完全梗阻性黄疸持续时间对大鼠肝切除术后肝再生的影响_临床医学论文.docVIP

完全梗阻性黄疸持续时间对大鼠肝切除术后肝再生的影响_临床医学论文 完全梗阻性黄疸持续时间对大鼠肝切除术后肝再生的影响_临床医学论文 作者：刘景丰， 张清华， 曾永毅， 黄新辉， 刘建煌 【摘要】 目的 探讨术前完全梗阻性黄疸的持续时间对大鼠肝切除术后肝再生的影响。 方法 建立完全梗阻性黄疸大鼠模型，测定梗阻不同时相的胆红素水平；选取梗阻0，1，3，7 d分为4组，即正常肝切除组（A组）、梗阻1 d肝切除组（B组）、梗阻3 d肝切除组（C组）及梗阻7 d肝切除组（D组），观察肝切除（肝切除量约70％）术后各组大鼠死亡率，检测肝切除术后0，12，24，48，72，168 h的肝功能指标，免疫组织化学检测残肝组织PCNA标记指数，RT法检测肝组织HGF基因的表达，检测术后7 d残肝质量/体质量的比值。 结果 B组在肝切除术后死亡率、肝功能恢复、PCNA标记指数、HGF mRNA表达及肝质量/体质量的比值等方面均优C组及D组，差别均有统计学意义（0.05）。 结论 术前高胆红素血症可明显抑制大鼠肝切除术后的肝再生；术前梗阻时间短、胆红素处于较低水平，扩大肝叶切除术才可能相对安全地进行。 【关键词】 黄疸，阻塞性； 胆管肿瘤； 肝切除； 肝再生； 疾病模型，动物 肝门部胆管癌90%以上合并有不同程度的梗阻性黄疸，且多为完全性梗阻。目前根治肝门部胆管癌的外科治疗策略是扩大肝叶切除[1]。然而，术前高胆红素血症对肝切除后肝再生有明显的抑制作用，术后易并发肝衰竭及感染等致命的并发症，死亡率高，故部分学者主张术前常规行经皮经肝穿刺胆道引流，可有效减轻黄疸［2］；但长时间引流可能引起肿瘤扩散、转移等，贻误手术时机。本实验拟通过动物实验探讨术前胆红素处于何种水平，在无需引流的情况下也可以相对安全的行扩大肝叶切除术，为肝门部胆管癌的手术治疗提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 动物模型制作及分组 6～8周龄SD大鼠204只，雌雄不限，体质量（248.94±12.33）g（240～260 g），由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2007。分为4组：（1）A组42只，即正常大鼠肝切除组，切除大鼠肝脏左中叶；（2）B组51只，即梗阻性黄疸1 d肝切除组，利用胆总管结扎诱导梗阻性黄疸，梗阻1 d后切除大鼠肝脏左中叶并在胆总管与十二指肠间架设原硅管引流，恢复胆汁正常通道；（3）C组54只，即梗阻性黄疸3 d肝切除组，具体手术方法同B组；（4）D组57只，即梗阻性黄疸7 d肝切除组，具体手术方法同B组。 1.2 标本制备 各组动物分别于肝切除后0，12，24，48，72，168 h取材。每个时相取6只，各组大鼠若有死亡，均予同批SD大鼠予以补充。所有到点的动物麻醉后称质量，肝下腔静脉抽血约3～5 mL，室温下3 000 r/min离心15 min，取上清液1.5 mL，EP管-70 ℃保存。切取大鼠右叶部分肝脏迅速投于液氮冷冻并保存于液氮罐中，切取1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小右肝组织浸入4%多聚甲醛中固定保存。各组大鼠均于术后7 d取材前切除大鼠肝脏并称质量。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 全自动生化分析仪（7700，日本HITACHI公司）检测各组大鼠术前谷草转氨酶 (AST)、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）及术后肝功能变化趋势；计算各组大鼠的死亡率。 1.3.2 肝脏组织PCNA免疫组织化学染色 兔抗鼠PCNA克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，二抗、SP试剂盒、显色剂DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色采用SP法。计数方法：在高倍镜下多个视野，带网格的目镜限定下计数1 000个细胞中核阳性细胞数，换算成百分比。 1.3.3 RT检测大鼠术后不同时相肝组织HGF mRNA表达水平 (1)采用Trizol试剂一步法提取肝组织匀浆总RNA，1％甲醛变性，琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测定纯度并定量；(2)逆转录扩增按RT试剂盒(美国Fermentas公司)说明在PCR仪(PCR system 2700型，美国PE公司)中进行，HGF、GAPDH引物序列参考文献[3]。 HGF mRNA（615 bp）： 上游：5’TTCC3’ 下游：3’ GAPDH（452 bp）： 上游：5’ 下游：3’ (3)将RNA逆转录为cDNA，42 ℃温育1 h，70 ℃变性10 min；(4)PCR扩增，94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s→55 ℃复性30 s→72 ℃延伸30 s，循环35次，最后72 ℃延伸4 min；(5)取产物在2％琼脂糖凝胶上电泳成像(美国BILRAD公司)。 1.3.4 称取各组大鼠术后7