定向基因传递载体pET15bZVP1的构建_临床医学论文.docVIP

定向基因传递载体pET15b的构建_临床医学论文 定向基因传递载体pET15b的构建_临床医学论文 【摘要】 目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区)，构建原核表达质粒pET15b。方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将Z片段插入原核表达质粒pET15b。结果 经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成Z重组基因;双酶切将Z插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并经酶切鉴定和DNA测序证实。Western blotting证明pET15b在体外表达重组蛋白VP1。结论 成功在VP1氨基末端插入Z区，构建了原核表达质粒pET15b，并体外表达重组蛋白VP1。 【关键词】 基因治疗;定向基因传递;JC病毒 )ABSTRACT:Objective To construct the vector pET15b JCV VP1. Methods The VP1 and Z fragment were amplified by PCR from plasmid pET15b and pEZZ18 respectively, and then they were linked by recombinant PCR. The ZVP1 fragment was inserted into plasmid pET15b by restriction enzyme BamHⅠ and NcoⅠ. Results The VP1 and Z fragment were obtained by PCR and gel purification. The ZVP1 fragment, which was linked by recombinant PCR from VP1 and Z fragment, was inserted into plasmid pET15b between BamHⅠ and NcoⅠ sites, and confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of VP1Z was confirmed by Western blotting. Conclusion The plasmid pET15bZVP1 has been constructed successfully by inserting Z fragment into aminoterminal of VP1. 　　KEY WORDS: gene therapy; targeted gene delivery; JC virus 　随着人口老龄化的迅速发展，许多中枢神经系统疾病将会严重威胁人们的健康。对于这些疾病至今仍缺少有效的治疗方法，基因治疗被认为是最有希望的方法之一，而制约基因治疗的核心是缺少理想的基因载体[1]。JC病毒(JCV)是一种嗜神经病毒，其主要外壳蛋白VP1在体外可自我组装成病毒样颗粒(VLP)[2]。研究证明[3]VLP具有与完整病毒相同的受体结合、胞吞转运等生物活性。在体外，VLP可经二硫苏糖醇(DTT)和EGTA裂解为VP1单体;含钙离子溶液透析时，VP1又可重新组装成VLP，并包裹外源性DNA[4]。因此，VLP具有基因载体的基本特性。 　　由于JCV受体广泛分布于多种组织来源的细胞表面[5]，因此，VLP作为基因载体缺乏组织细胞特异性。如能使其具有靶向性，特异性结合到靶细胞，则VLP有望成为一个理想的中枢神经系统基因载体。研究表明[67]，从金黄色葡萄球菌细胞膜提纯的蛋白质A(SPA)，能与IgG抗体Fc端结合，将SPA的IgG结合区(Z区)插入某一蛋白质，该蛋白质即具有IgG结合功能。体外限制性蛋白水解分析发现，JCVVP1氨基末端暴露于VLP表面，对VLP颗粒形状维持并非必需，体外修饰并不影响VLP的生物特性[4]。如果将SPA的Z区插入VP1氨基末端，体外重组病毒样颗粒(VLPZ)，不仅保持VLP原有的生物特性，同时也具有IgG结合功能。借助特异性抗体，VLPZ可特异性结合到靶细胞，实现治疗基因的定向传递。为此，本研究在JCV VP1氨基末端插入SPA Z区，构建原核表达质粒pET15bZVP1。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 质粒pET15bVP1由北海道大学医学部分子细胞病理研究室澤洋文教授惠赠， VP1片段全长1065bp。质粒pEZZ18购自Pharmacia Biotech公司，包含两个重复的Z片段，每个Z片段全长174bp。质粒pET15