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实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达_临床医学论文 实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达_临床医学论文 作者：杨晓煜， 姚建凤， 黄燕芳， 张孟璋 【摘要】 　　目的 建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法，检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异。 方法 通过实时荧光PCR，选择合适的“相对标准品”绘制相对标准曲线，检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平。结果 相对标准曲线有较好的线性（r=0.999及0.984）；实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升。 结论 双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠；传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平。 【关键词】 聚合酶链反应； 等位基因； 基因表达； 蛋白质类； 细胞，培养的； Grb10 　　Grb10是母本等位基因特异表达的印迹基因，通过编码特殊的衔接蛋白结合酪氨酸激酶受体，调节特定的信号传递过程。印迹基因表达的一个特点是依赖等位基因的亲本来源，即优先表达来自父本或母本的等位基因[1]。某一亲本等位基因的沉默是通过染色体的表观遗传修饰来完成的，染色体的修饰对基因转录密不可分，主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰。因此，检测小鼠印迹基因Grb10在经体外培养后表达水平的差异，是研究培养过程中表观遗传修饰影响印迹基因Grb10表达水平的重要基础。 　　实时荧光定量PCR是近年来使用的一种核酸检测技术，因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在生物医学、基础科研及医学临床中得到广泛应用。它是利用每一模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存着的线性关系，来定量模板初始拷贝数，从而实现极为精确的核酸定量检测。综合比较实时荧光PCR绝对定量和相对定量的各种方法，同时结合试验目的，笔者采用一种新的实时荧光定量PCR的方法来检测印迹基因Grb10的表达，即通过合适的相对标准品、系列稀释后构建相对标准曲线，获得与绝对定量标准曲线一致的斜率。因为定量结果只与曲线的斜率相关[2]，因此，可以实现比传统的相对定量法（2-△△ C T法）更为准确的定量结果，并且避免了绝对定量的复杂度和难度。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 杂交鼠B6D2F1(C57BL/6 x DBA2，6～8周龄)，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心[合格证号：SCXK（沪）2003。细胞培养用试剂购自上海水源生物技术服务公司。逆转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司（ReverTra Ace）。SYBR Green I荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa公司(SYBR Premix Ex TaqTM TaKaRa)。其余试剂无特别说明均购自美国Sigma公司。 　　定量PCR的Grb10、Gapdh引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。RNA定量采用紫外分光光度计（ND，美国Thermo公司），实时定量采用实时荧光定量 PCR仪（7500，美国ABI公司）。 　　1.2 鼠尾成纤维样细胞培养 参照文献[3]。剪约1 cm鼠尾组织，消毒后用培养液反复冲洗，转移至新培养皿，剪切至约1 mm×1 mm×1 mm组织块，移入湿润过的培养瓶，均匀摆布至瓶底，相互距离约0.5 cm。轻轻翻转培养瓶，瓶底向上，加入1 mL培养液（DMEM/F12，添加10%FBS和0.1～0.25%双抗），轻晃动使之分布均匀，置36.5 ℃温箱倒置培养约4～8 h，待其组织块贴壁，再缓缓把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖已贴附瓶底的组织块。培养约1周后，可见成纤维样细胞从组织块游离长出，适当添加培养液，获得原代成纤维样细胞。待其长满至约80%瓶底，连续传代过程中收集P1及P5细胞。 　　1.3 总RNA的提取与cDNA的合成 　　1.3.1 总RNA的提取与定量 收集P1及P5细胞，重悬、计数、离心（1 200 r/min，5 min），沉淀中加入Trizol，吹打后加入三氯甲烷，离心（1 200 r/min，5 min），沉淀加入丙醇；离心（1 200 r/min，5 min），乙醇洗涤，得到的RNA用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，用紫外分光光度计定量，-80 ℃保存。 　　1.3.2 cDNA合成 选择完整性良好的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。20 μL体系中含总RNA 100 ng，5×缓冲液 4 μL，dNTP mix（10 mmol/L）2 μL，抑制剂(10 mol/μL) 1 μL，逆转录酶 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，最后无RNA酶H2O至20 μL。逆转录程序为：42 ℃ 20 min→99 ℃ 5 min→4 ℃ 5 min，cDNA放-20 ℃