实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平_临床医学论文.docVIP

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平_临床医学论文 实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平_临床医学论文 【摘要】 目的 探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达的方法。方法 以BB270femA基因表达为标准，建立实时荧光定量PCR方法，对实验菌株femA表达进行相对定量。结果 建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一。随MIC变化，金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论 用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。 【关键词】 金黄色葡萄球菌；femA基因；实时荧光定量PCR Abstract： Objective To establish the approach of real-time fluorescent quantitative PCR to detect femA gene in Staphylococcus aureus strains. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to quantify the expression of femA gene of 15 clinical stains, as compared with BB270. Results The standard curve by real-time fluorescent quantitative PCR showed good linearity between the amount of femA RNA and cycle threshold and the melting curve had a single peak. The variation of expression level of femA was in accordance with MIC of strains. Conclusions The real-time fluorescent quantitative PCR in the detection of femA expression is accurate, sensitive and repeatable. Key words: Staphylococcus aureus; femA gene; real-time fluorescent quantitative PCR 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time Q-PCR）由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点，目前已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域中，其中最主要的应用集中在以下几个方面：DNA或RNA的绝对/相对定量分析，基因表达差异分析，基因分型。 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是全球感染性疾病领域研究热点之一。已知femA是MRSA耐药表达的重要辅助基因，与MRSA高水平耐药成正相关［1-3］，但还未见研究报道两者确切关系。本实验利用近年来兴起的实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA基因表达水平，进一步明确femA在MRSA耐药表达中的意义。同时建立实时荧光定量PCR用于金黄色葡萄球菌RNA定量检测的具体方法和稳定体系。 1 材料和方法 1.1 菌株和生长条件 我院微生物室从临床送检标本中分离鉴定所得金黄色葡萄球菌，选取MSSA 4株，低耐MRSA 4株，高耐MRSA 7株。1株瑞士捐赠株：BB270［1］。 上述金黄色葡萄球菌在M-H培养基复苏16 h，挑取菌落置于M-H肉汤中在37℃震荡培养，测量D600nm，10倍稀释10个浓度，取50 μl菌液过夜孵育，选取菌落数在100～300之间的稀释倍数计算活菌数。 1.2 最低抑菌浓度（MIC）测定 以琼脂平皿对倍稀释法测定苯唑西林对16株菌的MIC值，以ATCC 25923为质控株，结果判定参照CLSI2006常规标准。 1.3 RNA提取、纯化、逆转录 采用RNA提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司），操作按说明书进行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16 U/ml，上海生工生物工程有限公司）。测D260nm以及D260/D280，取D260/D280比值gt;1.8者继续下一步试验。采用RT-PCR试剂盒（TaKaRa生物工程大连有限公司），操作按照说明书进行。反转录反应：42℃，15 min，95℃，2 min。 1.4 real