家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化_临床医学论文.docVIP

家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化_临床医学论文 家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化_临床医学论文 作者：刘红美, 方小波, 郑勤妮, 胡仕明, 吴建伟 【摘要】 　　目的： 建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性（SRAP-PCR）扩增体系。方法: 以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。结果: 优化后的反应体系总体积为30 μl,含50 ng模板DNA、1.5 mmol/ L Mg2+、0. 20 mmol/ L dNTPs、0. 15 μmol/ L 引物和0. 50 U Taq DNA聚合酶。结论: 家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP 技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础。 【关键词】 蝇科; 随机扩增多态DNA技术； 遗传标记 　　［Abstract］Objective: To establish and optimize SRAP-PCR reaction system of housefly. Methods: Effects of concentrations of template DNA, Mg2+, dNTPs, primers and amount of Taq DNA polymerase on SRAP molecular marker amplification system of Musca domestica L were studied in monofactorial experiment, and the amplification system was optimized. Results: Total volume of the optimal system was 30μl containing 50 ng of template DNA, 1.5mmol/ L of Mg2+, 0. 20 mmol/ L of dNTPs, 0. 15μmol/ L of primers and 0. 50 U of Taq DNA polymerase. Conclusion: This system provides a useful tool for analysis of genetic diversity and gene location of Musca domestica L. 　　［Key words］ Muscidae; random amplified polymorphic DNA technique; genetic markers 家蝇( Musca domestica L )是重要的医学媒介昆虫,能传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎等多种疾病。近年来,随着家蝇体内抗菌肽的发现,家蝇在工业原料、医药保健和自然界物质能量循环等方面具有重要的应用价值。由于对家蝇的偏见,国内外从分子水平研究家蝇的报道还比较少,并且都只限于RAPD技术的利用[1]。相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP) 是一种基于PCR原理的新型DNA 分子标记技术,其技术的核心是PCR扩增,影响PCR扩增的因素都将影响到SRAP的成败。因此,对Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物这5个因子进行优化,建立适合家蝇DNA的SRAP-PCR 扩增体系,为SRAP系统在家蝇乃至昆虫中的研究鉴定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试材料 　　驯化家蝇由贵阳医学院寄生虫学教研室2000年建立种群,并在实验室进行多代种群繁殖。幼虫以麦麸、蛆浆、面粉和水混合物为饲料,饲养温度（25℃±1）℃,相对湿度为50%～60%,光照12 h。实验时选用肥大的3龄幼虫作为材料。 　　1.1.2 仪器、试剂 　　实验用PCR扩增仪为Eppendorf 5331梯度PCR仪; 10 ×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、琼脂糖和DL2000(Marker)等均购自大连Takara (宝生物)工程有限公司。SRAP引物由上海鼎安生物科技有限公司合成,引物名称及序列见表1。表1 SRAP引物及序列（略） 　　1.2 方法 　　1.2.1 家蝇基因组DNA的提取 　　采用徐书华等[2]人的方法，提取家蝇3龄幼虫基因组DNA,DNA 经紫外分光光度计和0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测和定量,将纯度好、杂质少的样品于-20 ℃保存用于PCR扩增。 　　1.2.2 PCR 体系、程序及检测 　　参照Li 等[3]的扩增反应体系。标准