密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染_临床医学论文.docVIP

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染_临床医学论文 密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染_临床医学论文 【摘要】 目的: 构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1。方法: 用PCR技术从988载体中获得L1片段, 将该片段克隆到pCR载体, 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 从而构建真核共表达载体pcDNA3.1通过水动力转染技术(hydrodynamics和脂质体细胞转染法(liposome检测衣壳基因的体内、 外转录情况; 重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化, 用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果: 酶切和测序结果表明真核共表达载体pcDNA3.1构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、 293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE（cytopathic effect）现象, 表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论: 成功地构建了pcDNA3.1共表达真核载体, 为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。 【关键词】 密码子优化 衣壳基因 共表达真核载体 细胞转染 　人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)属乳多空病毒科, 具有上皮细胞嗜性。迄今为止, 已分离到的基因型有100种以上［1, 2］。根据各型病毒的潜在致病性可将HPV分为低危型和高危型两类, 大量研究证实高危型中的16、 18型与宫颈癌的发生密切相关, 其中又以HPV16型最为常见。宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌致妇女死亡的第二大癌症, 据报道全球每年大约有50万宫颈癌新发病例, 约25万人死于该癌症［3］。因为乳头瘤病毒的增殖与上皮细胞的分化紧密相连, 所以一直以来感染性乳头瘤病毒只能通过烦琐的器官培养（organotypic cultures）和小鼠异种移植（mouse xenografts）途径获得, 而用这两种方法很难获得足量的野生型或突变型HPV颗粒, 这大大限制了乳头瘤病毒生物学许多方面的研究［4-6］。最近Pyeon［7］、 Culp［8］采用假病毒技术建立了用于病毒培养的瞬时转染系统, 该系统中每个细胞能产生大量有感染性的病毒, 病毒产生量是常规器官培养的1000倍之多。Pyeon的研究表明, 该瞬时转染系统要求密码子优化的L1与L2基因必须同时转染细胞, 而单独L1基因或L2基因都不会使该系统发挥作用。Pyeon采用的是pcDNA和pcDNA两种质粒进行共转染, 而本研究中, 我们构建的是密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体即pcDNA3.1通过连接子IRES实现了L1和L2基因在一个载体中的共表达, 无需同时转染两个质粒, 可大大简化实验操作。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 988质粒（德国科学家Martin Mueller惠赠）, pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）; 细胞株: 293T细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）; LA Taq DNA聚合酶和反转录试剂盒（购自fermentas公司）; 质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）; TOPO克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自Invitrogen公司）; 电转化感受态Top10菌（购自TaKaRa公司）; HPV16 L1单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）; 辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗鼠IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）; 其他试剂均为国产分析纯; 昆明白雌性小鼠（6～8周龄, 质量18～22 g）购自新疆医科大学动物实验中心。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 根据pcDNA3.1(+)载体和德国科学家Martin Mueller提供的密码子优化的HPV16 L1、 L2基因序列设计5条引物, 具体序列见表1。 　　表1 引物设计（略） 　　Tab 1 Primer design 　　1.2.2 密码子优化的pcDNA3.1重组质粒的构建 构建策略: 以988质粒为模板扩增L1基因片段, 将该片段构建到pCR载体上, 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取: 以988质粒为模板, 以HPV为引物, 在LA DNA聚合酶作用下, 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 67℃退火45 s, 68℃延伸4.5 min, 共30个循环, 68℃延伸30 min, 合成L1基因。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。pCR的构建: 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 切胶回收并纯化L1片段。按照TOPO克隆试剂盒说