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小分子肽制备抗体方法的研究进展_临床医学论文 小分子肽制备抗体方法的研究进展_临床医学论文 作者：郑树涛, 刘忠渊, 张富春 【关键词】 小分子肽 抗体制备 佐剂 偶联 　　许多生理调节所必须的因子都是很小的肽类, 生物技术的发展也促进了大量小分子基因工程肽类药物的出现, 因而小分子肽的分离、 纯化与鉴定技术日趋重要。小分子肽的界限划分迄今未有明确定义, 一般认为小分子肽的相对分子质量(Mr)均在3000以下[1]。在小分子肽的生物学功能、 鉴定与其相互作用的蛋白质的研究中, 特异性抗体是一重要的研究工具[2]。鉴于小分子肽仅有反应原性, 免疫原性较弱,因此在小分子肽制备抗血清过程中采取多种方法。 　　1 偶联载体和佐剂 　　由于小分子肽仅有反应原性, 免疫原性较弱或无免疫原性, 通常需与大Mr载体蛋白偶联制备完全抗原(免疫原), 借助载体蛋白的Ｔ细胞表位获得免疫原性, 以便刺激机体产生抗体[3]。制备完全抗原肽时常用的载体有牛血清白蛋白(BSA)、 钥孔血蓝蛋白(KLH)、 兔血清白蛋白(RSA)、 鸡卵清蛋白(OVA)、 人血清白蛋白(HSA)、 多聚赖氨酸(PLL)等。BSA是常用的多肽载体, 但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。因为与BSA偶联的多肽刺激产生的抗血清也含有针对BSA的抗体, 一次可能导致假阳性结果。KLH具有更高的抗原性, 是最为常用的多肽偶联载体。虽然KLH较大并有抗原性, 但在偶联过程中可能会沉淀, 因而有时候会很难处理。OVA是另一种可以使用的载体蛋白。当要检验抗体只是针对多肽而不是针对载体蛋白时, 用OVA作第二载体是很好选择。如果要将抗体抗载体蛋白的反应降到最低时,可以选用兔血清白蛋白做载体。 　　此外, 为获得更好的免疫效果, 常使用免疫佐剂。免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用, 能增强机体针对抗原的免疫应答能力, 或改变免疫反应类型的物质。佐剂的作用原理是多样的, 不同的佐剂有不同的免疫增强方式。近年来, 许多新型的载体和佐剂被应用于抗体的制备。脂质体（liposome）就是其中之一。脂质体是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊, 由一个或多个类似细胞单位膜的类脂双分子包裹水相介质所组成, 具有佐剂兼载体效应。脂质体的结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质体并破坏其膜结构, 释放抗原并形成免疫复合物, 有利于维持长时间的高效价抗体及产生免疫记忆。脂质体在宿主体内可以生物降解, 本身无毒性, 并且能降低抗原的毒性, 无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用, 效果更佳。但是由于其稳定性, 生产和质量保证等问题使的脂质体仍无法用于人类。 　　2 将小分子肽进行融合表达 　　在基因工程迅速发展的基础上, 有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起, 进而表达所需蛋白, 这种通过在人工条件下融合不同的基因编码区获得的蛋白质称为融合蛋白(FP)[4]。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术, 可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短, 费用低, 是科研中的主要工具。其缺点是原核蛋白表达没有得到确切修饰, 大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物, 需要复杂的变性和复性过程, 大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多, 甚至可被改造成人源型, 真核细胞易被转染, 具有遗传稳定性和可重复性, 产物可被分泌, 提纯简单, 成本低。 　　首先进行小分子肽基因的克隆:根据基因序列互补原则, 设计合适的引物序列, 以cDNA为模板, 利用PCR技术扩增出不同的目的的DNA片段。然后在载体中进行重组:通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收, 然后通过连接酶将两个具有相同的末端酶切位点的基因片段进行体外连接, 并克隆到高表达质粒载体中, 构建重组质粒。接着将重组表达载体转化/染宿主细胞并利用选择标记进行筛选及测序。最后是融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化[5]。原核表达载体pGEX是小分子肽进行融合表达最常用的载体。其启动子上游有一个GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签, 其Mr为26000, 将编码小分子肽基因亚克隆到该载体上, 进行融合表达, 可以增加其相对分子质量。这样, 以融合蛋白的方式制备小分子肽的抗血清既有抗GST, 也有抗小分子肽的抗血清。其他常用的原核融合表达载体还有pET等。Wang等[6]基于蓖麻毒蛋白A链的晶体结构, 把CDR3环上表达抗蓖麻毒蛋白A链抗体（命名为rVHPT）的cDNA（全长360 bp）亚克隆