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小鼠BCMA基因启动子活性研究_临床医学论文 小鼠BCMA基因启动子活性研究_临床医学论文 【摘要】 目的: 探索B淋巴细胞成熟抗原（BCMA）基因5′上游序列的启动子活性, 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。方法: 构建由BCMA基因5′上游-820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3、 pGL3、 pGL3、 pGL3、 pGL3通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达, 观察荧光素酶相对活性。结果: 5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3。pGL3在3种细胞中的转录激活能力为J558Lgt;HeLagt;293T, 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞。结论: BCMA基因5′上游序列“-820 bp～+145 bp”具有启动子活性, 核心启动子可能位于-93～+145区域中。 【关键词】 BCMA 启动子 报告基因 　　B淋巴细胞成熟抗原(B为B细胞表面分子, 属于肿瘤坏死因子受体家族(TNFR), BCMA由184个氨基酸残基组成, 其胞内部分由80个氨基酸残基构成, BCMA的功能及作用机制迄今尚未阐明［1-3］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾结构, B细胞发育正常, T细胞非依赖性免疫反应和T依赖性免疫反应未见明显异常［4］, 但浆细胞明显减少, 证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用。迄今对BCMA的研究主要集中于BCMA在B淋巴细胞发育中的作用, 及BCMA蛋白质的功能分析, 而对其自身的表达调控机制知之甚少, BCMA基因5′侧翼区基因组测序尚未完成, BCMA基因翻译起始位点前965 bp 5′侧翼区为未知序列。我们采用报告基因分析的方法, 构建了由BCMA基因5′上游不同长度片段驱动的报告载体, 通过转染不同细胞检测荧光素酶的表达, 初步探索了BCMA基因的5′上游序列启动子活性和BCMA启动子在不同细胞中活性的差异, 为进一步寻找和定位BCMA 5′上游序列内重要的顺式作用元件, 研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 菌株JM109为本室保存, J558L购自上海午立生物有限公司, 293T细胞购自中科院协和医学院细胞中心, HeLa细胞为本室保存。pGL3系列报告基因载体和 pRL表达质粒均为Promega公司产品, pUCm载体为上海博亚公司产品。Kpn Ⅰ、 Xho Ⅰ、 T4 DNA连接酶购自美国NEB公司, 基因组抽提试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒购自北京天为时代公司。DMEM培养基、 RPMI1640培养基购自Gibco公司, LipofactinamineTM2000购自美国Invitrogen公司, 双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司, 定点突变试剂盒购自美国Stratagene公司。电转仪为美国Bio公司产品, TD20/21化学发光检测仪为美国Promega公司产品, ND微量紫外分光光度计为德国Nanodrop公司产品。J558L细胞采用RPMI1640培养液, 293T和HeLa细胞采用DMEM培养液。 　　1.2 方法 　　1.2.1 小鼠BCMA基因片段的扩增、 克隆及序列分析 抽提小鼠骨髓瘤细胞J558L基因组, 设计PCR引物, 上游引物含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”, 下游引物位于翻译起始位点“ATG”前, 含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”。以J558L细胞基因组为模板, 扩增BCMA基因上游序列-820～+145片段。引物在北京三博远志公司合成, 设计如下: PB820。 PCR反应条件: 95℃, 5 min; 94℃, 60 s, →61℃, 60 s, →72℃, 90 s, 30个循环; 72℃, 10 min。970 bp PCR产物经8 g/L凝胶电泳回收并纯化, TA克隆入pUCm载体, 转化大肠杆菌DH5α, 挑出白色菌落, 得到T经KpnⅠ/ XhoⅠ双酶切鉴定, 并于三博远志公司测序鉴定。 　　1.2.2 BCMA基因报告载体的构建及鉴定 设计不同PCR上游引物, 含KpnⅠ酶切位点及保护碱基“GG”。下游引物相同, 位于翻译起始位点“ATG”前, 含XhoⅠ酶切位点及保护碱基“CCG”, 序列设计为BCMA。分别扩增BCMA基因5′上游序列 -820～+145、 -607～+145、 -359～+145、 -157～+145、 -93～+145 5个片段。上游引物名称、 扩增片段大小、 上游引物序列 如下: (1)BCMA（965 bp）: 5′（752 bp）: 5′TGTCG3′; (3