小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建_临床医学论文.docVIP

小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建_临床医学论文 小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建_临床医学论文 【摘要】 目的: 克隆小鼠CXCR4基因启动子, 并建立CXCR4报告基因系统。方法: 设计合成PCR引物, 从小鼠基因组DNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的启动子区。序列测定确认后, 用克隆的启动子片段构建CXCR4荧光素酶报告基因载体pGL。转染细胞, 用双报告基因系统检测报告基因载体的活性。结果: 成功扩增了小鼠CXCR4基因的启动子区。克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列。通过转染细胞和荧光素酶分析, 证实所构建的报告基因可以反映CXCR4启动子的活性。结论: 成功扩增、 克隆了小鼠CXCR4基因启动子, 并成功建立起其报告基因系统, 为后续的研究奠定了基础。 【关键词】 CXCR4; 基因; 启动子; 报告基因 趋化因子受体CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子（CXCL12）的特异受体。CXCL12对淋巴细胞等细胞有强烈的趋化作用［1］。CXCR4是最初用来分离纯化艾滋病毒的几个趋化因子受体之一。另外, CXCR4还可能人类胚胎发育中的着床过程中起作用。CXCL12是CXCR4的配体, 绝大数趋化因子受体有多个配体, 一个趋化因子可以结合到两个或多个受体。而CXCR4和CXCL12比较特殊, 它们是一对一的受体配体关系。CXCL12在造血干细胞移居骨髓中在起到重要作用。例如, 影响或阻断CXCR4受体配体结合, 可以调节造血干细胞的迁徙, 这对骨髓造血干细胞移植可能十分有用。此外, 研究还发现, 体内抑制CXCR4的表达将引起pDC及其前体细胞数量的减少。而给予CXCL12则可以促进前体细胞向pDC分化［2］。其他小组的结果证实CXCR4可以调控DC的成熟与存活, 使用CXCR4的抑制剂可以抑制骨髓来源DC的生成, 尤其可以减少其中成熟DC的比例［3］。CXCR4基因剔除小鼠在胚胎发育早期死亡, 伴随有多种组织器官的发育障碍, 说明了CXCR4具有广泛而重要的生物学功能［4］。作为发育过程最为重要的调控分子之一, 其表达必定受到严格的调控。最近, 我们在研究造血系统发育中发现小鼠CXCR4的表达在骨髓的前体细胞和外周的成熟细胞之间可能不同（待发表）。这一结果提示在前体细胞和成熟细胞之间可能存在CXCR4表达的动力学调控。为了探索CXCR4启动子在其中的可能作用, 本研究克隆了小鼠的CXCR4基因启动子, 并利用克隆的启动子片段构建报告基因系统。 1 材料和方法 1.1 质粒、 细菌品系和细胞系 T克隆载体pMD和报告基因载体pGL3分别购自TaKaRa公司和Promega公司。NIH3T3细胞系由本室保存。大肠杆菌DH5a由本室保存。Dual购自Promega公司。 1.2 细胞培养和转染 NIH3T3细胞用Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)培养基（补充100 mL/L胎牛血清和2 mmol/L的L谷氨酰胺）在50 mL/L CO2 37℃, 饱和湿度条件下进行培养。细胞转染用脂质体（Lipofectamine 2000, 购自Invitrogen公司）介导进行。细胞培养于6孔板中。当细胞生长至85%接触时, 更换培养液, 然后缓慢滴加脂质体混合液。培养6 h后再次更换培养液, 并继续培养至下一步试验。 1.3 基因组DNA提取和PCR 取0.5 cm小鼠尾巴剪碎, 加入消化缓冲液（10 mmol/L Tris, 75 mmol/L NaCl）500; 小心吸取上清约340 μL, 加入冰无水乙醇680 μL, 反复μL、 蛋白酶K 100 μg, 55℃消化过夜。消化完全的鼠尾组织, 12 000 r/min离心5 min, 收集上清液约490 μL, 加入饱和平衡酚490 μL, 40 r/min颠倒混匀30 min, 12 000 r/min离心10 min。同法进行酚氯仿和氯仿抽提, 然后加入无水乙醇, 混匀沉淀, 12 000 r/min离心5 min, 弃上清, 750 mL/L乙醇洗涤后50℃烘干1 min左右, 待乙醇挥发后, 加入100 μL灭菌去离子水, 50℃ 30 min溶解, -20℃保存。利用以下引物扩增小鼠CXCR4基因的启动子区-703～+77片段: CXCR4 。 1.4 分子克隆 DNA酶切、 连接、 大肠杆菌转化等分子克隆操作完全按照《分子克隆》一书进行。DNA序列分析委托TaKaRa公司进行。 1.5 报告基因试验 NIH3T3细胞进行常规细胞培养, 转染前2×104/孔接种入96孔板, 每孔应用脂质体Lipofectamine 2000转染0.1 μg报告质粒和5 ng phRL