小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达_临床医学论文.docVIP

小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达_临床医学论文 小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达_临床医学论文 作者：王莉, 胡轶阳, 王耀春, 韩骅 【摘要】 目的: 克隆小鼠CXCR4基因并建立其慢病毒表达系统。方法: 设计合成PCR引物, 从小鼠骨髓有核细胞来源的cDNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的编码区。构建CXCR4表达单元后通过转染细胞, 观察GFP的表达证实其表达效能。然后建立慢病毒表达载体, 包装慢病毒后感染培养的细胞, 用流式细胞术分析其在被感染的细胞中的表达。结果: 成功扩增了小鼠CXCR4基因的编码区。克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列。通过转染细胞和流式细胞术以及荧光显微镜观察证实了CXCR4的表达效能。成功构建了CXCR4慢病毒表达载体, 感染细胞后经流式细胞术分析, 证实被感染的细胞可以表达小鼠CXCR4。结论: 成功扩增、 克隆了小鼠CXCR4基因, 并成功建立起其慢病毒表达系统, 为后续的基础和应用研究奠定了基础。 【关键词】 CXCR4; 基因; 表达; 慢病毒 CXCR4是趋化因子SDF1a的受体, 广泛表达于机体的多种组织细胞。CXCR4广泛参与胚胎发育、 神经发生、 造血和创伤修复和肿瘤侵袭转移等生理和病理过程。CXCR4基因剔除小鼠在胚胎发育早期死亡, 伴随有多种组织器官的发育障碍, 说明了CXCR4具有广泛而重要的生物学功能［1］。在细胞水平, CXCR4不仅介导细胞针对其配体SDF1a的趋化性迁移, 而且调控细胞的增殖、 分化和凋亡等细胞生物学行为［2, 3］。例如, 树突状细胞（dendritic cells, DC）是体内功能最为强大的专职抗原提呈细胞。2007年, Kabashima等［4］报道了SDF1a信号途径不仅对DC的迁移十分重要, 而且发现这一信号通路还在DC的生存和成熟中发挥重要作用［5］。Kohara等进而证明, 当浆样DC（plasmacytoid DC, pDC）在骨髓基质细胞龛中发育时, 也需要CXCR4信号。此外, 大量的其他研究还证明CXCR4也在其他类型的细胞中发挥类似作用。 最近, 我们在研究中发现CXCR4可能是骨髓单核细胞来源的DC成熟的重要调控分子, 这一结果提示干预CXCR4有可能应用于DC相关的细胞治疗［6］。为了探索这一可能性, 本研究克隆了小鼠的CXCR4基因, 并利用慢病毒表达系统进行了表达。 1 材料和方法 1.1 材料 质粒、 细菌品系和细胞系: 逆转录病毒载体pMx由本室保存。慢病毒表达载体pLenti和包装细胞293FT由预防医学科学院北京病毒研究所吴小兵教授提供。HeLa细胞系由本室保存。大肠杆菌DH5a由本室保存。抗小鼠 CXCR4抗体和Avidin购自BD Pharmingen公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养和转染 细胞用DMEM培养基（含100 mL/L胎牛血清和2 mmol/L的L谷氨酰胺）在50 mL/L CO2、 37℃、 饱和湿度条件下进行培养。细胞转染用脂质体（Lipofectamine 2000, 购自Invitrogen公司）介导进行。细胞培养于6孔板中。当细胞生长至85%接触时, 更换培养液, 然后缓慢滴加脂质体混合液。培养6 h后再次更换培养液, 并继续培养至下一步试验。 1.2.2 RNA提取和RT采集正常小鼠骨髓, 用0.14 mol/L NH4Cl裂解红细胞后得到骨髓有核细胞。向细胞沉淀中直接加入TRIzol提取液（Invitrogen）裂解细胞, 经过酚氯仿抽提后得到总RNA。以随机引物为引物、 利用反转录试剂盒（TaKaRa公司）将总RNA反转录成cDNA, 再利用以下引物扩增小鼠CXCR4的编码区基因: CXCR4。 1.2.3 分子克隆 DNA酶切、 连接、 大肠杆菌转化等分子克隆操作完全按照已有进行。DNA序列分析委托TaKaRa公司进行。 1.2.4 慢病毒包装和感染 CXCR4的cDNA与IRES融合后, 共同插入pLenti载体中并替换掉其中EGFP片段, 得到慢病毒表达载体pLenti。病毒包装过程如下: 接种2×106 293FT细胞于90 mm大皿, 次日细胞基本覆盖皿底的95%以上; 于5 mL的离心管中加入1.5 mL无血清1640培养液, 在其中加入18 μg包装复合物和6 μg pLentiCXCR4EGFP质粒, 轻柔混合; 取另一支5 mL离心管, 加入1.5 mL无血清1640培养液, 在其中加入60 μL脂质体2000, 室温静置5 min; 将二者轻柔混合, 室温静置20 min。吸弃293FT细胞培养液, 3 mL PBS洗1遍, 将质粒脂质体混合物滴加到培养皿中, 轻柔摇匀, 37℃培养过夜。第2天