小鼠HMGN2干扰质粒psilencecmv4.1HMGN2构建及体内干扰效果鉴定_临床医学论文.docVIP

小鼠HMGN2干扰质粒psilence构建及体内干扰效果鉴定_临床医学论文 小鼠HMGN2干扰质粒psilence构建及体内干扰效果鉴定_临床医学论文 作者：韩琴 邓璐霞 赵静 吴桂霞 曹玥 范波 李夏 陈善泽 高祥 黄宁 【摘要】 目的：构建小鼠HMGN2干扰质粒psilence，以进一步明确HMGN2的生物学作用。方法：将HMGN2片段退火后与小鼠psilence链接，饲养孕小鼠，尾静脉注射法导入shRNA表达质粒，提取8.5d胚胎RNA，用RT检测胎HMGN2的表达量进行鉴定。结果：测序结果显示psilence干扰质粒构建成功，RT结果显示HMGN2在8.5d胎儿表达较高广泛表达，且Psilencer尾静脉注射后有明显的抑制效果。结论：成功构建对8.5d胎鼠HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer干扰质粒，为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。 【关键词】 HMGN2;Psilencer HMGN2是染色体的构组成分，可能与维持DNA分子的构型、基因的活化有关。人类基因组中有多个与HMGN2的cDNA具有相同序列的拷贝，目前认为拷贝数达35-50个之多[1]，也就是说HMGN2的编码基因属于一多基因家族，而这一多基因家族的大多数成员是不表达蛋白质的假基因，属于加工过的假基因(Processed Pseudogene)。这种多基因家族一般是细胞功能调节的关键性基因，常被称为看家基因(Housekeeping Gene)[2,3]。目前通过人鼠基因杂交的方法发现人类HMGN2多基因家族中的功能基因仅有一个，它定位于一号染色体1P36.1[4]。全长3450bp，由六个外显子构成，其基因上游是富含GC(75%)的区域，另外其上游启动子区域包含一个“HTF”岛以及在其他看家基因中常见的调控序列[5,6]。此外，HMGN2基因的编码序列在各物种中具有高度的保守性，例如：人与牛和鸡的同源性分别达96%和92%，这一切说明HMGN2基因具有看家基因的特点，可能在生物的进化和细胞功能中起到重要作用。 　　目前对HMGN2功能的认识尚不完善，众多学者比较一致的观点是HMGN2可能与DNA的复制与转录活性有关[7]。早在上世纪八十年代Swerdlow和Stein等人[8]就提出HMGN2与核小体结合，能稳定核小体核心小体(Core Particle)的空间构象使之更容易被DNaseⅠ消化。一些实验结果表明HMGN2具有消除染色体结构阻碍性的生物活性。尽管对于HMGN2的作用机制研究日益加深，但迄今为止对其的认识仍很有限。本研究旨在通过小鼠HMGN2干扰质粒Psilence构建及干扰效果鉴定，进一步明确HMGN2的生物学作用，深入阐明其调节转录的分子机制以及对于其他基因表达的调控作用机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料及试剂 　　表达质粒Psilence，PEGFPN1质粒购自clontech公司(USA)。RT试剂盒，T4连接酶,胶回收试剂盒(Takara公司);质粒提试剂盒(赛百盛公司);DNA重组所用的各种限制性内切酶(晶美公司);提取及纯化细胞总RNA所用Trizol、逆转录试剂盒(Invitrogen，美国);连接试剂盒(上海生工)。氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(kana)(华北制药厂)，宿主菌Ecoli DH5α由本室保存。BCA蛋白提取试剂盒(南京凯基生物有限公司)，Omega去毒素提取试剂盒，western blot所需缓冲液(成都宝信生物耗材有限公司)，HMGN2以及组蛋白抗体(santa cruze,USA)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 设计HMGN2的干扰序列 　　设计2对长度为19 bp的小RNA干扰片断，其中序列1、2为候选的有效干扰片断，阳性对照以及阴性对照，所有片断均通过BLAST软件验证其正确性。合成的互补DNA序列以备定向克隆入psilence干扰序列1、2如下所示： 　　序列1：正义链：5TAGCAGACAACCTCGCAGATCA3 　　反义链：5 　　序列2：正义链：5 　　反义链：5 　　1.2.2 构建小鼠psilencemv4.1HMGN2质粒 　　室温下用0.5ml无菌小离心管中建立退火缓冲液反应体系，95℃水浴孵育。离心，温和翻转混匀，制备成50μM双链DNA。取载体Psilence分别使用BamHI和HidIII双酶切，Takara的胶回收试剂盒回收，取双链产物5μl，加水至体积为10μl，充分混匀，16℃过夜。采用CaCl2法常规制备DH5a感受态宿主菌，转化DH5a感受态宿主菌，涂布于含有Kana的LB培养基平板，37℃培养过夜。选数个菌落接种于3 ml含Amp的LB液体培养基中，固定于37℃摇床上，震荡培养。离心、收集菌体，提取并纯化质粒，PC