GM-CSF在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.docVIP

GM-CSF在特发性肺纤维化大鼠肺 蔡欣 梁标 [摘要] 目的：通过阐明肺纤维化过程中粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平在肺纤维化大鼠肺组织的表达，探讨GM-CSF在特发性肺纤维化发病机制中的作用。方法：40只健康成年雌性大鼠随机分为模型组20只和正常对照组20只，模型组气管内一次性注射博来霉素５ｍｇ·ｋｇ-1 [关键词]肺纤维化；博来霉素；GM-CSF 前言 特发性肺纤维化（IPF）是一种严重影响人们生活质量和生命健康的疾病，其发病机理复杂，与诸多因素有关，发病过程中有多种炎症细胞参与(1)。粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种细胞因子 方法 实验动物 40只3月龄近交系健康成年雌性SD大鼠(SPF级)（本校实验动物中心提供），体重200±20g。动物实验室温度22±2度,湿度54%. 二、药剂与试剂 1、羟脯氨酸（Hyp）测试盒及羟脯氨酸测试前处理碱水解试剂 购自南京建成生物工程研究所。 2、博来霉素 由日本化药株式会社 3、GM-CSF ELISA试剂盒 由美国Biosource生物工程公司生产。 4、非变性裂解缓冲液 购自北京五洲元业生物工程有限公司 三、方法： （1）将40只大鼠随机分为两组，分别为模型组和正常对照组，①模型组予2％戊巴比妥（30mg/kg）腹腔内注射后，逐层暴露气管，气管内一次性注入博来霉素5mg·kg-1，注射后将大鼠直立旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合伤口。②对照组气管内给予与模型组博来霉素等量的生理盐水。每组分别在1，3，7，14天各处死5只。 动物处死后进行以下操作： 肺组织病理标本的制备：将心肺完整取出，结扎左主支气管，分离左肺，取左下肺用10%福尔马林固定，石蜡包埋，用于病理观察。取左上肺于液氮保存。制成肺细胞匀浆用于GM-CSF ELISA测定，取右肺于液氮保存，用于羟脯氨酸测定(3)。 （2）病理学检查： 根据Szapiel的方法确定肺泡沿河肺纤维化的程度。用ＨＥ染色的病理切片将肺泡炎分为４期：（1）无肺泡炎；(2)轻度肺泡炎(Ⅰ级)；（3)中度肺泡炎(Ⅱ级)；(4)重度肺泡炎(Ⅲ级)(4)。 （3）肺组织匀浆GM-CSF测定： 取组织块(g)在冰冷的生理盐水中漂洗，剪碎将剪碎的组织倒入玻璃匀浆中，一起倒入匀浆管中匀浆，将捣杆上下转动研磨，充分研碎，使组织匀浆化将制备好的10%匀浆用低温离心机000r/min左右离心10分钟，取上清液，弃下面沉淀上清液 （4）肺组织羟脯氨酸测定：取右肺，沉重后剪碎，每克肺组织加无菌生理盐水４ml，以3000r/min离心10min，过滤得上清液，用碱水解法测定羟脯氨酸含量。严格按说明书操作。 （5）统计方法： 实验数据用用数据用X±S表示表示，用SPSS统计软件进行t检验。P0.05，差异有显著意义，P0.01差异有非常显著意义。 结果 1，一般情况 治疗前各组体重差异无显著性，模型组组第7、14天组体重均较对照组明显下降，各相应天数模型组组大鼠进食，活动等一般情况均较对照组差。 2，肺组织病理变化 对照组：第1-3天肺间质中有少量巨噬细胞、中性粒细胞。淋巴细胞等炎症细胞浸润，肺泡隔略增宽，此后无明显异常。模型组：第1天可见肺间质和肺泡腔内有部分中性粒细胞、肺泡巨噬细胞渗出，肺泡壁略增宽；第3天可见肺泡壁水肿，肺内中性粒细胞、淋巴细胞增多，尚有部分嗜酸性细胞；第7天可见肺间隔增厚，局部肺泡塌陷，有大量炎症细胞渗出，嗜酸性细胞较第3天多，成纤维细胞、毛细血管开始增生；第14天肺泡眼开始消退，中性粒细胞显著减少，肺间质成纤维细胞进一步增生，纤维组织呈网状，絮状分布于气管周围及间质中。 3，肺组织羟脯氨酸含量测定 第1，3天组羟脯氨酸含量无明显差异，第7天模型组羟脯氨酸含量明显升高，第14天组模型组肺组织羟脯氨酸含量明显大于对照组（p0.01）。羟脯氨酸在胶原蛋白中占在弹性蛋白中占极少量,其它蛋白中均不存在因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织中的胶原代谢情况。 分组 1天组 3天组 7天组 14天组 模型组 1.63±0.45 1.69±0.13 1.66±0.3 1.66±0.03 对照组 1.66±0.16 1.70±0.56 2.68±0.07 3.37±0.05 *与对照组相比，第7，14天p0.01 4，GM-CSF Elisa测定 1天模型组与对照组肺匀浆中GM-CSF含量无明显差异，第3天，7天，14天组模型组肺匀浆中GM-CSF含量均明显高于对照组（P0.01）,其中第3天模型组肺匀浆中GM-CSF含量显著升高，第7天与第14天有所下降，(p0.01)；对照组第1，3天肺匀浆中GM-CSF含量稍微增高，第7，14天时下降。 表2、大鼠肺匀浆中GM-CSF含量(pg/ml) 分组 1天组 3天组 7天