第章细胞生物学研究方法.ppt

1）电子照明系统 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 2）电磁透镜成像系统：物镜、中间镜、放大镜为中空圆柱体，由线圈调节电流大小，以次改变磁场强度。 3）真空系统：真空泵，一般分机械泵和扩散泵两级 4）记录系统：荧光屏、感光胶片 3. 电镜的基本构造 电镜成像的原理 在真空条件下，电子束经高压加速后形成极细的快速电子束流，即电子射线。当它与样品发生作用时，由于样品的厚度和质量有差异，能产生多种带有样品信息的讯号。这些带有样品信息的电子束流经物镜作用产生样品的最初放大像，接着经中间镜和投影镜两种电磁透镜再次放大之后，带有样品信息的电子最终激发荧光屏，形成能用肉眼观察的电子显微图像。 电镜与光镜光路图比较 （二）主要电镜制样技术 表现样品的二维超微结构、应用广泛的超薄切片技术； 显示表面超微结构、立体感较强的扫描电镜样品制备技术 呈现生物膜的断裂面超微结构的冷冻蚀刻技术； 用于细胞内化学成分的定性和定位研究的电镜细胞化学技术； 进行细胞内抗原（抗体）的定性和定位研究的免疫电镜技术； 探测细胞内大分子合成、运输动态过程的电镜放射自显影技术； 研究病毒和生物大分子等悬浮材料的负染术. 1.超薄切片技术 普通超薄切片术指不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。它包括取材、固定，脱水、渗透、包埋、聚合、切片、染色等几大部分。其中每一部分都是重要的环节，与观察结果密切相关，所以为了得到可靠和满意的结果，需要步步谨慎认真。 超薄切片技术 1）取材和固定 取材和固定要遵照“准”、“快”、“轻”、“优”的操作原则。 固定液：2％～5％戊二醛 1％四氧化锇（即锇酸） 2）脱水 原因：A. 生物样品中水分的比例可达70％～80％以上，而水中又有85％～90％为游离态水，如包埋前不彻底除去游离态水，将造成切片困难和成像模糊等。 B. 单纯的烘干会使样品收缩，破坏其超微空间结构。 脱水剂的配制和脱水方法 最常用的是乙醇和丙酮。一般用乙醇脱水时，其浓度梯度为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，每步10～15分钟。另外，100％一步要重复一次，70％以前需在4℃条件下操作，从80％起可转至室温。 3）包埋与聚合 包埋的目的是聚合成硬块的单体树脂，一方面要支撑样品本身的超微结构，另一方面使能切片。把具有这种特性的单体树脂称为包埋剂。 环氧树脂类包埋剂 4）超薄切片与染色 修块 制刀 切片 载网 支持膜电子染色 醋酸双氧铀对富含有羧基和磷酰基的结构有广泛而明显的染色效果，如：脱氧核糖核酸（DNA）、蛋白质和结缔组织等。 柠檬酸铅细胞核与核蛋白颗粒对铅离子的亲和力强。 电镜的标本制备－超薄切片技术 电镜下细胞超微结构 2.负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 Negative Stained Actin 3.冰冻蚀刻freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 冰冻蚀刻技术 样品冷冻 断裂 蚀刻 喷镀 复型 深度蚀刻技术 显示原生动物四膜虫纤毛轴丝的电镜照片。 箭头指出一排特意动力蛋白外臂。 4.电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学的主要实验手段。 ATP合成酶 由X-射线晶体衍射(2.8A)所揭示的核小体三维结构（引自K.Luger等，1997） a.通过DNA超螺旋中心轴所显示的核小体核心颗粒8个组蛋白分子的位置；b．垂直与中心轴的角度所见到的核小体核心颗粒的盘状结构； c．半个核小体核心颗粒的示意模型，一圈DNA超螺旋（73bp）和4种核心组蛋白分子，每种组蛋白由3 个α螺旋和一个伸展的N-端尾部组成。 N-端尾部有序排列，参与核小体之间的相互作用，以形成螺线管等高级结构。 5.扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM） 20世纪6