第讲PCR和DNA测序.ppt

* * * ? * * * * * * 第二代DNA测序技术 现有的技术平台主要包括：Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。 三个技术平台各自的优点： 454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp； Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10； SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，目前第二代测序技术中准确度最高。 核心思想：边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。 例如，Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理：在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的 双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses) 双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序 1977年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法 原理：与加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp. Seq 测序峰图 单分子DNA测序仪 美国Helicos BioSciences公司研究人员近日称，他们开发出了一种新型的测序设备——单分子DNA测序仪（single-molecule DNA sequencers）。该仪器能够“阅读”单分子DNA的单个碱基。 相关研究文章发表在2008年4月4日的《 Science》 《Science 》，Vol. 320. no. 5872, pp. 106 – 109，Timothy D. Harris，Zheng Xie 传统上，在测序之前，要先对DNA链进行扩增。这一过程往往会引入错误，并且对某些DNA片断来说无法很好地实现，从而使得对整个基因组进行测序变得尤为困难 Helicos BioSciences公司估计，新仪器能够用8周的时间测序一个人的基因组，代价是7万2000美元，而仪器本身则价值135万美元 1000美元/人的宏伟基因组测序计划,论文第一作者Timothy Harris认为，这一目标将会在5年以内实现 总结 PCR 技术要点： * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1、热启动PCR 热启动PCR（hot start PCR）是一种改良的PCR方法，可有效避免非特异性扩增。 将DNA聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，避免在未达到设定温度前就开始反应。 热启动PCR有几种方式： 蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应物加入PCR管后，加滴熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入PCR仪开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反应物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。 热启动聚合酶（化学型）：经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动。 热启动聚合酶（抗体）：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动。 热启动聚合酶（共价键结）：改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。 2、TD-PCR 即touchdown PCR，降落PCR。 指每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，直至达到一个较低的退火温度（touchdown退火温度）。然后以此温度进行10个循环。 正确和非正确退火温度1℃差异将造成PCR产物量4倍的差异，如果相差5℃，就会产生4的五次方（1024）倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。 退火温度起始在高于计算的Tm值15℃左右，再接下来的循环中，退火温度以每次1-2℃逐渐降低，直到Tm值以下5℃，当达到特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增就会开始。 当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。 此法扩增可利于PCR产物纯化。 TD-PCR注意事项 由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。 设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高