PCR常见问题总汇_1.doc

PCR常见问题总汇 何谓PCR?简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内?(In?Vitro)?的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。?PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板?(Template)?２.界定复制范围两端的引物(Primers).?３.DNA聚合酶?(Taq.?Polymearse)?4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1).?Denaturation?2).?Annealing?of?primers,?and?3).?Extension?of?primers。?所谓?Denaturing乃是将DNA加热变性，?将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板.?而Annealing?则是令?Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。?最后在DNA聚合酶?(e.g.?Taq-polymerase)?的作用下进行引物的延长?(Extension?of?primers)及另一股的合成。PCR的历史?PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现?(DNA?polymerase?I),?而较具有实验价值及可得性的Klenow?fragment?of?E.?Coli?则是于70年代的初期由Dr.?H.?Klenow?所发现,?但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,?因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素?(简称?Taq?polymerase),?则是于1976年从热泉?Hot?spring中的细菌(Thermus?Aquaticus)?分离出来的。?它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制?(DNA?repair?replication)，它是于1971年由?Dr.?Kjell?Kleppe?提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制?(类似PCR前两个周期反应)?的实验。?而现今所发展出来的PCR则于1983由?Dr.?Kary?B.?Mullis发展出的，Dr.?Mullis当年服务于一家物科技研究公司?(Perkin-Elmer?Cetus?Corporation).?目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis?并于1985年与?Saiki?等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在?1989?年，Science?将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子?(Molecule?of?the?year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。?影响PCR的因素?PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员Henry?Erlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业”(PCR?allows?people?to?practice?molecular?biology?without?a?liscence)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度?(Taq.?Polymerase,?primers,?dNTPs,?MgCl2…)，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然DNA模板(Template)?与?引物?(Primers)?本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如?Dimethyl?sulfoxide?(DSMO)、glycerol、Foramide?and?Tetramethylammonium?chloride?(TMAC)?也对整个反应产生若干重要的影响。?PCR的运用?PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常?(Gene?mutation,?deletion,?and?rearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；?对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取?(DNA?sequencing)?及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。?也可以做DNA指纹?(Fingerprints)?比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移