PCR技术的发展和应用.ppt

* 第五节 PCR技术的扩展和应用 多重PCR (Multiplex PCR) Inverse PCR Nested PCR Anchored PCR 不对称PCR技术 Tail-PCR 多重PCR(multiplex PCR) 1.原理 在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物,针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。这一概念由Chamberian等于1988年提出。 优点：多重PCR同时扩增多个目的基因,可节省时间、降低成本、提高效率,特别是节省珍贵的实验样品。 2. 应用 2.1 医学研究与应用 如病原微生物的检测与鉴别，可同时进行多种病原微生物的鉴定。 2.2 植物学研究 在植物分子育种、基因表达研究、种质纯度鉴定、病虫害检测等方面,多重PCR 也得到重视。 2.3 海洋生物学研究 海洋浮游生物数量庞大，种类繁多，而且幼体时期外形相似。研究发现，不同种类浮游生物细胞色素氧化酶I 的DNA差异明显，据此，研究者可通过设计特异性引物，采用多重PCR 方法进行分类鉴定。 3.多重PCR的技术要素 一个理想的多重PCR 反应体系，并非单一PCR 的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复试验，建立适宜的反应体系和反应条件。多重PCR 的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量等。多重PCR 的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。 目的片段必须具有高度特异性， 各个目的片段之间需具有明显的长度差异，以利于鉴别。 各个引物必须高度特异，避免非特异性扩增;不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。 复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有目的片段的长度。 多重PCR 反应中，在Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度以确保PCR 反应的特异性。 复性时间略微延长，以使引物与模板之间完全结合。 延伸反应的时间不宜过长，否则会导致非特异性扩增带的出现。 反应体系中适当增大模板DNA、引物、聚合酶、dNTP的用量，调整缓冲液组分，以获得最佳扩增效果。 反向PCR（Inverse PCR, IPCR） 扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列 此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，克隆基因的邻接序列以及建立基因组步移文库等。 IPCR技术一般只能获得2. 0 kb以内的片段。 DNA的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组中的相对专一性是IPCR 成功的关键: (1) 如果DNA酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。 (2) 在酶解片段的自连接反应中，如果DNA浓度过高或反应体积过小，则可能导致生成串联多聚体。 (3) 普通IPCR反应使用的引物一般长20 nt，退火温度相对较低，在以总基因组DNA的酶解自连物为模板进行扩增时，很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的生成。可以使用较长的两个特异引物 ( 25 nt～30 nt) ，退火温度高，可最大程度地减少由引物非特异匹配引起的假阳性片段扩增。 巢式PCR （Nested PCR） 利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。第一对引物：外部长片断扩增引物；第二对引物：内部短片断扩增引物。巢式PCR是为了从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩增出的片段也称套组片段。两类产物（外长和套组片段）的 Tm值是不同的，因此在外引物和套组引物与各自靶位点融合的温度不同。 在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中，早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外引物5ˊ端增加多个GC钳子（GC- clamp）达到扩增片断的目的。 第一次循环时，外引物的融合温度只能比没有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后，由于GC- clamp已导入初级产物，因此以后的融合温度可以提高。 由于采用了两种不同退火温度的引物，所以巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序中某个阶段一些引物工作，另一些引物 “休闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工作。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR的特异性。