6.分子病理学1.ppt

杂交组织化学-概述 一、概述和原理 杂交组织/细胞化学 (Hybridohistochemistry) 原位分子杂交 (In situ hybridization, ISH) 运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化 学技术在组织切片 ( 或细胞片 ) 上显示特异核酸 ( DNA或RNA ) 序列的一种技术。 核酸分子杂交种类：固相杂交 (硝酸纤维素膜或尼龙膜) Southern印迹转移(DNA) Northern印迹转移(RNA) 液相杂交 原位杂交 原位杂交四要素： 适当的探针 良好的组织材料 可靠的试剂和方法 相当的形态学基础 二、探针的制备 1.探针的种类和制备 DNA探针：应用多，操作容易 比较敏感，背景高(自身网络) 双链DNA探针用时要变性 整合 转化 扩增 DNA片段 ─── 质粒(或其他载体) ─── 细菌─── 提取 酶切 ─── 质粒 ─── 探针 ( PCR 扩增 ) RNA探针：结合稳定，穿透性好 无需变性，不存在退火问题 未杂交探针可用RNase去除，背景好 多采用体外转录法合成同时加以标记 寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对RNase不敏感 30-150bp，组织通透性好 未端标记，敏感度不够 多采用DNA合成仪固相合成 探针的选择: 特异性 多选择基因组的5或3端 20-50对碱基互补就已稳定 大 小 200-300对碱基互补可获强的复合体 原位杂交多选择100-400bp(1000bp) 种 类 稳定性：RNA-RNA DNA-RNA DNA-DNA 2.探针的标记 标记物：同位素, 非同位素, 修饰物 同位素：敏感，定位较差，实验室要求高 探针使用周期短 32P放射过强,定位差,半衰期短(14.3天) 35S最常用,定位好,曝光时间短(数天),半衰期较长(84天) 125I与35S相似，但半衰期较短(60天) 3H常用,放射能小,定位准确, 曝光时间长(数周),半衰期长 非同位素：定位较好，实验室要求低，可长期使用 生物素：最早用，特点与免疫组化相似 地高辛：最常用，敏感性高，特异性好 荧光素：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查 修饰物(现少用)：磺基化(Sulphon基团) 乙酰氨基芴 光敏生物素 汞 标记方法 引入法：运用标记好的核苷酸合成探针 缺口翻译法 随机引物法 末端标记法 PCR扩增标记法 RNA体外合成法 化学修饰法：化学修饰已合成的探针 缺口翻译/平移法：双链DNA标记，线环状均可 分子较大(1KB)者效果好 DNA用量较多(200