常用生物化学检验技术67604.ppt

常用生物化学检验技术 光谱分析技术 电化学技术 电泳技术 层析技术 离心技术 自动生化分析技术 光谱分析 分光光度计的基本结构 光源 单色器 比色杯 检测器 显示器 光 源 光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，有足够强度和稳定性 可见光分光光度计——钨灯 紫外光光度计——氢灯 单 色 器 将光源的复合光分散为单色光的装置 滤光片 棱镜 光栅 比 色 杯 玻璃或石英 光径为0.1~10cm,一般为1cm 校准 检 测 器 光信号转为电信号 光电管及光电倍增管 显 示 器 检流计、微安表、记录器 透光度和吸光度 数字显示器 透光度和吸光度和浓度 操作方法 开关——打开比色池盖子——20分钟预热 选定预定波长 空白、校准或待测液放入比色池，空白置于光路中 开光于T位，打开比色池盖子，粗、细调T为0.0关上比色盖子，调T为100.0 开关于A，用消光调零 重复步骤4和5 将校准或待测液光路中测A 分光光度技术的定量方法 标准曲线法 条件变应重新绘制 标准品纯且准 待测液吸光度超过线性范围，应稀释再测 待测液与标准曲线条件相同 比较法 CU=(AU×CS)/ AS 火焰光度法(原子发射光谱) 原理 标本原子（基态）→激发态→释放光能→不同原子有不同特征光谱线→浓度与发射光强度成正比 钠的特征谱线为589nm 钾的特征谱线为767nm 电泳迁移率是带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度。 即反映带电粒子在每厘米降为1伏特（V/cm）的电场强度下每秒钟内移动的厘米数（cm/s）。 μ=V/E=(1/t)/E=1/tE= cm2/V.s μ为电泳迁移率， V为粒子移动的速度（cm/s），即1/t E为电场强度（V/cm） T为时间（秒） 1为移动的距离（cm） μ为蛋白质电泳的特征常数 μ的单位为cm·s·v 电泳速度（V）与其电量（Q）和电场强度成正比，而与粒子的半径（r）和介质粘度系数（η）成反比，即 V=QE/6πrη这样 μ=V/E=Q/ 6πrη 影响电泳的因素 1、分子的形状和性质 2、电场强度 电场强度大，速度快，产热多，变性； 电场强度小，速度慢，产热少，区带模糊 常用的区带电泳 滤纸电泳（PE已淘汰） 醋酸纤维薄膜电泳（CAE） 琼脂糖凝胶电泳（AGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 电泳区带的测定 区带染色 溴酚蓝、丽春红 （蛋白质） PMS-NBT系统 （同工酶） 苏丹红、苏丹黑 （血浆脂蛋白） 溴化乙啶 （核酸） 区带定量 光密度扫描法 洗脱比色法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 层析技术 利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、极性、亲和力、分配系数等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，从而以不同速度移动而分离。 组成成分 pH pH与pI比较，4.5-9.0,正极pH 负极 离子强度 离子强度越大，缓冲容量越大，pH越稳定，电泳速度越慢，标本扩散，产热多，蒸发快；0.05-0.1mol/L 3、缓冲液 5、蒸发作用 6、样品 4、支持物 吸附作用 电渗作用 电 泳 仪 由直流电源和电泳槽两部分组成。一、直流电源 一般由交流电经过整流获得 恒压电源 恒流电源 恒功电源 二、电泳槽 盖 电极及电极室 支架 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称为等电聚焦电泳。 进行等电聚焦电泳的条件 1.有一个在电泳条件下基本稳定的、 重复性良好的pH梯度。2.有一个抗对流的电泳材料。3.电泳后有适当的方法来鉴定 分离的区带。 双向电泳是先把样品从一个方向进行电泳分离，接着再与其成90°方向进行第二次电泳分离。 第一次电泳以其电荷性质为基础；第二次电泳则按分子量不同进行分离。 * * 概念：利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析方法 发射光谱 火焰光度法、原子发射光谱法、荧光光谱法 吸收光谱 紫外、可见光、红外光及原子吸收分光光度法 散光光谱 比浊法 光谱分析技术 分光光度技术的基本原理 透光度与吸光度 T=I/IO T%=T×100% A=-lgT=-lg I/IO =lgIO/I Lambert-Beer定律