第二章 基因工程制药 新版4.ppt

（五）动物细胞中基因导入和表达 1、转基因动物的历史 2、反转录病毒法构建 3、显微注射法构建 4、优点 5、缺点 1、转基因动物的历史 转基因动物(transgenic animal）:通过基因工程技术将外源DNA导入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，并在染色体上整合，稳定传给子代的技术，转基因技术诱导基因组改变的动物称转基因动物。 1982，Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠的受精卵中获得巨型小鼠（supermouse），从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高一步，引起生物学界极大的关注，为基因工程育种提供诱人的前景。 外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系 2、 反转录病毒法构建 利用反转录病毒可以转移小片段DNA（≤10kb） 3、 显微注射法构建 在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。 5、优点 （1）基因的表达产物可以迅速通过细胞分泌到培养液之中， （2）培养液成人完全能够进行人工控制， （3）基因产物在动物细胞内已经进行了糖基化，更加接近于天然产物。 6、缺点 （1）动物细胞生长慢。 （2）单位体积的生产率低。 （3）培养条件要求苛刻、费用高。 （4）由于用于基因表达的细胞均为传代细胞，而一般认为传代细胞都是恶化性细胞，因此，由它所生产出的基因表达产物有可能存在致癌的疑问。 关键： 融合蛋白与外源蛋白的阅读框要对齐 两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融合蛋白的操作。 （D1）融合表达载体的构建 （D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质） （D3）受体蛋白的切除方法 化学断裂法：溴化氰（CNBr）--Met-（切点）-AA 酶促断裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序列:Ile－Glu－Gly－Arg-（切点）-AA （2）非融合蛋白 [A]、定义 [B]、优缺点 [C]、具体表达方式 [A]、定义 非融合蛋白表达方式是指工程菌大肠杆菌进行蛋白质翻译时，是以真核生物的mRNA的AUG为翻译起始点，最后表达出的蛋白质中不含细菌蛋白。 非融合蛋白表达方式也称为包涵体型外源蛋白的表达。 [B]、优缺点 优点----非融合蛋白能够较好地保持真核蛋白质的生物活性。 缺点：（1）容易被细菌体内的蛋白酶所破坏，（2）非融合蛋白的氨基端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时常常引起人体的免疫反应。 [C]、非融合蛋白的具体表达方式 非融合蛋白表达方式可分为2种： （C1）非融合基因—非融合蛋白 （C2）融合基因—非融合蛋白 （C1）非融合基因—非融合蛋白 基因结构为“原核启动子—原核SD序列—ATG—真核结构基因序列—原核终止密码子” 要求1：SD序列和ATG之间的距离要合适，相差2-3个碱基，其表达效率就大受影响。 要求2： ATG和真核结构基因序列之间必须加接人工接头，以保证ATG之后的真核基因不发生通读框架的改变。 （C2）融合基因—非融合蛋白 基因结构为“原核启动子—原核SD序列—原核ATG—TGATG（真核基因起始结构）—真核结构基因序列—原核终止密码子” 这一方式能够提高表达效率。 （3）分泌型表达蛋白 [A]、定义 [B]、分泌蛋白表达的原理图示 [C]、常用的大肠杆菌信号肽 [D]、优缺点 [A]、定义 分泌型表达蛋白是利用大肠杆菌的信号肽基因来构建分泌型表达系统，将外源基因接在信号肽基因后，当表达的目的蛋白跟随着信号肽来到细胞周质，被细胞周质中的信号肽酶识别而切除,从而释放有生物活性的蛋白质。 基因结构为“原核启动子—原核SD序列—原核结构基因片段—细菌信号肽基因—真核结构基因序列—原核终止密码子”。 [B]、分泌蛋白表达的原理图示 [C]、常用的大肠杆菌信号肽 碱性磷酸酶信号肽（phoA） 膜外周质蛋白质信号肽（OmpA） 霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB） [D]、优缺点 优点：（1）表达时没有活性的蛋白质，通过信号肽切割，能产生有生物活性的蛋白质，（2）分泌的蛋白质产物由于经过切割，不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸，不会引起人体的免疫反应。 缺点：（1）产量不高，（2）信号肽不进行切割或不能定点切割。 3、影响真核基因在大肠杆菌表达的因素 （1）外源基因的拷贝数量 （2）影响转录水平的因素 在目的基因上游，必须安装一个适当的启动子。常见的启动子有lac、trp、tac、bla等。 （3）影响翻译水平的因