第二章 基因工程制药 新版7.ppt

（二）基因工程生产人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 SH SH SH SH C C C C COO_ SH SH N C C S.S. Pre-pro-insulin S S S S C C C C COO_ S S C C S-S Pro-insulin N S S S S C C C C COO_ C C S S S-S insulin N 基因工程人胰岛素生产工艺 （1）A链、B链分别表达法 （2）人胰岛素原表达法 （3）分泌型人胰岛素原表达法 基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列 表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链分别表达法 1 synthesis 表达产物后的处理路线： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 A链和B链分别表达法 生产技术评价 为了进一步降低生产成本 , 美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。 基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达法 proinsulin 表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感 在人胰岛素原表达工艺中 , 由于C肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达80%以上。 生产技术的评价 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每克最终产品的成本仅50美元。 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与β -內酰胺酶基因拼接 , β -內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。 分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。 HOMEWORK How to express insulin in E. coli, design the process. * 3.2氨基酸组成及顺序分析 氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 顺序分析 质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法 各类氨基酸自动测序仪 （4）重组蛋白质浓度、相对分子量测定 重组蛋白质的浓度测定方法：（1）凯氏定氮法（蛋白质平均含氮量为16﹪，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量）（2）双缩脲法（3）Bradford法（4）福林-酚法（5）紫外分光光度法（芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收） 重组蛋白质的相对分子量测定方法：（1）凝胶过滤法 （2）聚丙烯酰胺聚胶电泳法 电泳法测定未知蛋白的分子量 （5）蛋白质二硫键分析 二硫键的巯基与蛋白质的生物活性有着密切关系。基因工程产物中-S-S-键是否正确配对为一个重要的问题。 测定方法：（1）对氯汞苯甲酸法（PCMB）（2）5、5-二巯基-双-2-硝基苯甲酸法（DTNB） 2、纯度分析 目的蛋白质含量测定通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。 采用的方法有4项：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAEG）（2）等电点电泳（3）各种高效液相分析法（H