HRM在水产领域中的应用.ppt

HRM在水产领域中的应用 内容提示 1 高分辨熔解曲线(HRM)简介 2 HRM在水产领域中的应用 3 问题与展望 HRM技术的发明 HRM技术是由美国犹他大学保健科学中心病理学部Carl Wittwer实验室与美国Idaho公司于2003年共同合作开发出来的新技术，并于2006成功生产出世界上第一台商品化的HRM仪器HR-1。 Luming Zhou 什么是HRM？ 高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）是通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种技术。它是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术。 饱和荧光染料 LC Green plus —— 高分辨溶解曲线常用荧光染料 高分辨溶解曲线结果 HRM分析流程 PCR:在反应前加入LC Green荧光染料 时间大约2小时（包含试剂准备） 在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析 大约需要5-10 分钟 数据分析和处理 大约需要5-10 分钟 如果需要，PCR产物可以直接进行下游的测序分析等 大约需要30-60分钟 2005 LightScanner 96/384 96/384 孔板 ~8 分钟/板 ~2-6 秒/样品 温度均一性：? 0.15oC 数据采集速度：大于100pts/秒 升温速度： 0.1oC/秒 2010 LS32 32 样品转盘, 玻璃毛细管 HRM 检测 60 分钟内完成定量 PCR 和 HRM 检测 HRM检测升温速度可以在 0.05 ～ 0.90oC/秒之间调节 在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC 数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有关） 0.3oC/秒 升温速度= 67 pts/ ℃ 0.05oC/秒 升温速度 = 400 pts/ ℃ 内容提示 1 高分辨熔解曲线(HRM)简介 2 HRM在水产领域中的应用 3 问题与展望 1.基因突变扫描与基因分型 Smith B L.等用小片段+内标探针和未标记探针，对箭鱼（Xiphias gladius）种群的乳酸脱氢酶（ldh-A），肌球蛋白轻链-2（mlc-2），酸性核糖体磷蛋白P0（ARP）和钙调蛋白（CaM）中的核基因进行基因分型。结果表明，HRM是一个研究野生种群基因分型的强大工具。 Smith B L., Lu C., Bremer A. High-resolution melting analysis (HRMA): A highly sensitive inexpensive genotyping alternative for population studies. Molecular Ecology Resources,2010,10(1):193-196. 2. 品种鉴定 HRM可以应用于微生物品种、物种快速鉴定以及动植物品种鉴定。 McGlauflin M T.等利用高分辨率熔解曲线（HRM）发现了11个新的鉴别虹鳟和切喉鳟的SNPs。发现HRM能准确地识别DNA序列的核苷酸变化。 McGlauflin M T., Smith M J., Wang J T., Young S F., Chen N., Lee Y C. High-resolution melting analysis for the discovery of novel single-nucleotide polymorphisms in rainbow and cutthroat trout for species identification. Transactions of the American Fisheries Society,2010,139(3):676-684. 内容提示 1 高分辨熔解曲线(HRM)简介 2 HRM在水产领域中的应用 3 问题与展望 HRM 的缺陷 对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高 突变扫描不能精确区分扩增片段中的不同杂合突变 HRM对于大片断插入或缺失不敏感 PCR扩增产物的长度受到限制 展望 高分辨率熔解曲线在基因分型、突变扫描与序列匹配研究中非常简便,近几年来在医学领域中发展迅速。饱和荧光染料的普及、未标记探针与实时定量PCR的结合,使得该技术无论在速度、灵敏度、准确性,还是在经济上都很符合检测要求。高分辨率熔解曲线技术不仅将在医学领域被广泛应用,还会广泛应用于动物基因检测、植物病理、微生物分型和食品安全检测等方面。相信将来也会广泛地应用到水产领域中。 谢谢！ * Part 2 of our afternoon double feature is the instrumentation aspe