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基因工程9DNA文库的构建.ppt
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 ? cDNA 克隆时常出现丢失末端序列的现象,需较长时间获得全长 cDNA 克隆。 cDNA 克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得 3‘ 末端和 5’ 末端的序列。工作原理见后图。筛选文库时一般只能回收一个或几个 cDNA 克隆, 而 RACE 可产生大量独立克隆。引物 GSP1 根据已经得到的不完整的 cDNA 的序列设计。 (3) RACE( random amplification of cDNA ends)?? 第三节 基因克隆的筛选策略 一般来说,这一筛选过程的难易程度,主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有:核酸杂交法、特异性抗原的免疫学检测法、PCR筛选法。 基因克隆的本质:从文库中筛选目标克隆,重点在筛选。 常见筛选工具:探针(probe) 狭义:核酸,抗体 广义:还包括其他筛选手段。 ??? 生物体的表型特征由控制其性状的基因编码。因此,可以通过观察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编码比较特殊的功能,并且载体的帮助下可以在宿主菌(如大肠杆菌)中表达该基因,表现出其特殊的功能所决定的表型性状来,这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。 一、表型筛选法 抗性基因:抗生素抗性基因、抗重金属抗性基因 分解基因:苯环化合物、分解酶 功能活性:杀虫、酶 启动子/复制子: 功能缺失:在获得相应突变体的前提下,以此突变体作为宿主,将野生型的DNA导入后检测回复突变(如:营养缺陷型相关的基因)。 * * * * 基因组DNA文库:将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 cDNA文库:若这些阳性菌落中所含的外源DNA不是基因组DNA,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA,则称之为cDNA文库。 构建基因文库的基本程序: 提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片段,或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA; DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA; 重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌; 阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 第一节 基因组DNA文库的构建 一、基因组DNA文库的类型和发展 质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库 亚基因组文库 鸟枪法(霰弹法):利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断,随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组,转化受体菌后进行无性繁殖,获得一大群含不同外源DNA片段的克隆,再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株,从中获得所要的基因。 代表性:指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组,即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。 文库构建策略:①采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ,以保证克隆的随机性,保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等;②提高文库所含基因组 DNA 的总容量,通常用覆盖基因组的倍数来衡量。 二、文库的代表性和随机性 三、基因组DNA文库构建流程 载体的制备; 高纯度大分子量基因组 DNA 的提取; HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离(PFGE size selection); 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞; 重组克隆的挑取和保存。 1.基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求:①纯度高;②去磷酸化好。 2.高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切?? 提取的基因组 DNA 要求保存完整。 分子量越大,所得到的重组克隆的插入片段越大。 3.文库的连接转化或包装侵染?? 在电转化和包装侵染过程中,首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白;同时,研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外,对于电转化而言,选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 4.文库的质量检测 文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库,一般要求植物的在 130kb 左右,而动物的在 150kb 左右。
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