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α-淀粉酶系列实验 xxx （云南大学 生命科学学院 生物学基地班xx） 摘要：α-淀粉酶作用于淀粉时可从分子内部切开α-1,4糖苷键，而生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。α-淀粉酶系列实验包括α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS法）的测定、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性的测定七个方面的内容。通过本系列实验，我们不仅掌握了关于酶的基本实验操作技术，而且对酶特别是α-淀粉酶的特性也有了更深刻的理解。 关键词：α-淀粉酶，发酵培养，分离提纯，酶活力测定 1、材料和方法 1.1、α-淀粉酶酶活力测定（碘比色法） 酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测，即淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）。具体方法如下： 1.2、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测 分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）； 分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落； 检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断； 实验流程： 1.3、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定 摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的，浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）.根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基.细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的营养物质，细胞代谢活性较高。 流程如下： 1.4、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验 利用正交试验所选试验的“均匀分散，齐整可比”特点，通过其中对部分试验结果的分析，从而达到了解全面试验的情况，最终完成用部分试验来代替全面试验的目的和结果。 基本流程如下： 1.5、α-淀粉酶酶活力测定（DNS法） 淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 流程如下： 标准曲线的制作 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 标准麦芽糖溶液 （mL） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 （mL） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 麦芽糖含量 （mg） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 DNS试剂 （mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 酶活力测定步骤 酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。 1.6、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化 酶的粗提取方法：降低酶蛋白在溶液中的溶解度，使酶蛋白从溶液中沉淀出来，从而达到分离的目的。 离子交换层析： 1.7、α-淀粉酶（纯化后）生物学特性测定 1.7.1、最适温度的测定 准备稀释好的酶液（根据DNS法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5），确定好稀释倍数后，酶液少稀释10倍（比确定浓度高10倍）——酶用量为0.1mL，利用反应管中加入的0.9mL蒸馏水再稀释10倍，从而恢复至反应时的酶浓度。 按下表加入反应底物及进行酶促反应过程（取7支25mL比色管，其中1支为对照管）： 编号 1 2 3 4 5 6 对照 ? 不同反应温度（℃） 反应温度（℃） 30 40 50 60 70 80 40 1%马铃薯淀粉反应底物（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 加入蒸馏水量 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 预热时间（min） 5 5 5 5 5 5 5 稀释酶液加入量（mL） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 反应时间（min） 10 10 10 10 10 10 ? DNS试剂加入量（mL） 2 2 2 2 2 2 2 煮沸显色时间（min） 5 5 5 5 5 5 5