植物TAG合成途径相关基因的克隆与分析.doc

植物 TAG 合成途径相关基因的克隆与分析 植物种子中的油脂主要以三酰甘油（TAG）的形式储存，TAG形式的产品在食品、保健品和工业产品方面都具有较大的经济价值 （王镜岩，2000）。为了对含油量相关基因的功能进行深入分析，本研究克隆或合成了催化整个三酰甘油合成途径的含油量相关基因。利用同源序列法从油菜中克隆含油量相关基因DGAT的全长cDNA序列，对它们的序列特征进行了生物信息学分析. 2.1 材料与方法 2.1.1 材料 2.1.1.1 供试植物材料 甘蓝型油菜（Brassica napus L）中双 9 号（ZS9）基因组 DNA 用于本研究目的基因的分离，种子由本实验室保存。 2.1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli.）克隆菌株 Top10，购自 Invitrogen 公司；克隆目标基因载体 pAmp由本实验室吴刚博士构建，商业化植物转化载体 pBI121（Kanr）购自 ToYoBo 公司。 2.1.1.3 酶与生化试剂 ReverTra Ace-α-TM 试剂盒、 高保真DNA聚合酶（Kod Plus）购自ToYoBo公司； 1kb DNA Ladder Marker、 Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司； Trizol购自Invitrogen公司; T4 DNA连接酶购自NEB生物公司； 限制性内切酶其它工具酶皆购自宝生物工程（大连）有限公司和NEB公司； PCR纯化试剂盒购自百泰克生物技术有限公司， 质粒小量提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司； LB培养基成分，Car、Kan、Rif、Str等抗生素购自国内相关厂商； PCR引物合成由上海生工生物技术公司完成。 测序由华大基因研究院武汉测序中心进行。 2.1.1.4 仪器与设备 上海福玛实验设备有限公司恒温培养箱； GRANT－000751 制冰机； eppendorf centrifuge－5415、5424 离心机； 上海福玛实验设备有限公司三孔恒温水浴锅； 中国科学院武汉科技仪器厂HQ452 恒温摇床； Fisher scienticfic Isotemp 3016 连接仪； Millipore 纯水仪； eppendorf centrifuge－5417 冷冻离心机； BIO-RAD 双模块 PCR 仪； 美的微波炉一台； BIO-RAD 电泳仪； BIO-RAD凝胶成像系统； eppendorf 各种规格移液枪一套。 2.1.2 方法 2.1.2.1 油菜叶片组织 RNA 的提取与 RNA 的反转录 a) 称取 100 mg 油菜叶片置于研钵中，加液氮迅速用力将叶片碾成粉末，收集粉末至液氮预冻的 2.0 ml EP 管； b) 向管中加入 1 ml 的 Trizol 和 50 μl 的 β-巯基乙醇，盖紧 EP 管后迅速用力摇晃，直到粉末充分混入试剂； c) 加 200 μl 氯仿，同样用力混匀，室温静置数分钟； d) 12000 rpm，4℃离心 15 min； e) 取上清,加等体积的氯仿，混匀； f) 12000 rpm，4℃离心 5 min； g) 取上清,加等体积的异丙醇，混匀，于室温静置数分钟； h) 12000 rpm，4℃离心 15 min，RNA 即以胶状沉淀形式附着于管底； i) 加 1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀； j) 12000 rpm 离心 5 min，弃上清。移液枪吸走剩余液体，置超净台上数分钟使乙醇挥发； k) 加 50 μl DEPC 水并吹打沉淀使其溶解。 检测，琼脂凝胶电泳 第一链 cDNA 的合成采用 ReverTra Ace-α-TM 试剂盒完成，使用 Oligo(dT)20 和随机引物进行反转录反应，体系如下： 1×ReverTra buffer 2 μl dNTP 1 μl Oligo(dT)20 1 μl Random primer 1U RNase inhibitor 1U ReverTra Ace 2 μl 总 RNA DEPC 处理过的水补充体积至 20 μl 反应程序为 30℃ 5 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min。反应所得 cDNA 稀释 20 倍后分装，即可用于 PCR 扩增。 2.1.2.2 克隆基因所使用的引物 PCR 扩增克隆基因引物根据 GenBank 中的相应基因的 mRNA 序列从非编码区与编码区相连处分别设计表引物： 2.1.2.3 克隆基因的 PCR 反应体系及条件 目的基因扩增 PCR 反应体系包括 1μ