激光多普勒用于脑血流的测量.doc

应用DIC显微镜观察神经递质对大鼠脑片血管作用的方法 实验准备： 器械：剪刀、止血钳、不锈钢铲、50ml、250ml烧杯、注射器、培养皿、剃须刀片、玻璃钩、滤纸、加样器、尼龙筛（尼龙网和直径6cm塑料瓶盖制成）、尼龙弓玻璃电极毛胚。 尼龙弓 移脑片管 加样器 可加热载标本台 2．仪器：微分相差干涉显微镜（DIC,带水浸镜头，LEICA DMLFS） 微分相差干涉显微镜及图像摄像记录系统 图像摄像记录系统（HAMAMASU Camera controller, C2400－60、Japan） 振荡切片机（Vibroslice） 玻璃电极拉制仪（SUTTER INSTRUMRNT COMPANY） 分子式 分子量 工作浓度（g/L） 1L 2L 4L NaCl 58.44 124 7.247 14.494 28.98 KCl 74.55 3 0.224 0.448 0.896 NaHCO3 84.01 26 2.184 4.368 8.736 NaH2PO4·2H2O 156.01 1.24 0.193 0.386 0.772 MgSO4·7H2O 246.47 2.0 0.493 0.986 1.972 *CaCl2 110.99 2.0 0.222 0.444 0.888 *C6H12O6·H2O 198.17 10 1.982 3.964 7.928 *用前加入，以免浑浊或污染。 4.玻璃电极制备：玻璃电极拉制仪按使用说明操作。 实验程序: 脑片制备： ACSF置冰箱中至冰晶形成。 冰盒内放入50ml烧杯，加冰ACSF；手术器械在冰面上预冷，培养皿倒置冰面上，上覆一条滤纸，滴加ACSF。在250ml烧杯内加入100ml左右ACSF，再放入尼龙筛。在切片盒内加入冰ACSF。向ACSF内通入CO25%O295%混合气。在标本台上加502胶。 50－150g大鼠用剪刀断头，迅速取脑，放入50ml烧杯内，用不锈钢勺取出放培养皿上，剃须刀片切取相应部位，干滤纸条蘸干水份，并粘于标本台上。振荡切片，片厚350-500μm，用吸管转移脑片至500ml烧杯尼龙筛上，25℃孵育1h备用。 仪器及设备连接： ACSF倒入滴瓶内，输液管连于记录槽入液口，调节流速1ml/min，打开蠕动泵排出液体，通入CO25%O295%混合气。打开水浴锅，利用虹吸原理给载标本台加温，使记录槽温度保持载32℃。 打开电脑、显示器、摄像记录系统、显微镜光源、电动holder。 镜下观察神经递质对脑血管的作用： 用吸管将脑片移入记录槽，尼龙弓固定脑片。63×水浸镜头下观察脑片状态，脑片选取以神经元状态良好为准（神经元胞体和突起清晰，立体结构明显）。寻找血管形态清晰，带有梭形平滑肌的血管。 预先用ACSF配制所需浓度的神经递质溶液，用加样器加入溶液，必须用手指轻弹排除气泡，装入holder。 在5×镜下，调节holder，使电极尖端置于显示屏中心点，到电极和脑片皆清晰为止，转换63×镜头（务必先将镜头抬起，再转换）。在63×水浸镜头下，仔细控制holder，将电极置于血管旁1-2μm。微电泳仪正极与玻璃电极相连，负极联入记录槽。电流强度20μA。 给予刺激后观察血管舒张和收缩情况。 另外一种给药方式： 同3.1。 用进样器直接在记录槽中加药(需要计算好给药浓度，保持记录槽中液体体积恒定，稀释后为最终工作浓度),同时观察和记录血管变化。血管的选取需要靠近脑片上表面。 注意事项： 必须保证脑片活性，否则直接影响实验结果。影响脑片状态的主要因素有：ACSF的PH值，保证在7.4左右；取脑的速度，必须快，最少要在1min内完成；修整脑块的时间尽可能短；ACSF的温度（呈冰水混合状态最好）；在孵育时，脑片不能重叠，并使其两面都能接触到ACSF。 显微镜和holder使用一定要细心，认真操作，摸索经验。 玻璃电极充夜时一定要排出气泡，否则不能将药导入。 示例： Histamine 对大鼠脑皮质血管的作用 赵建军 email: zhaoj@mailst.xjtu.edu.cn 激光多普勒用于脑血流的测量 LDPM原理 激光由光纤到探头尖接触的组织。光线进入组织，被散射或吸收。激光照射区内运动的血细胞散射光，使光发生频移，这种频移称为多普勒效应。组织内非多普勒频移和多普勒频移光混合在一起。频移光与非频移光量的