13第十三章遗传工程动物.ppt

* 二、逆转录病毒法制备转基因动物 （一）原 理 逆转录病毒是一类具有逆转录酶的RNA病毒，能将病毒RNA逆转录成双链DNA，进而整合到细胞染色体DNA中。利用这个特点，可将逆转录病毒改造成外源基因表达载体，用于基因治疗研究和转基因动物的制备。 逆转录病毒科有三个亚科： RNA肿瘤病毒亚科 慢病毒亚科 泡沫病毒亚科 * 逆转录病毒结构 LTR: Long terminal repeat，在5‘末端具有启动子/调控序列作用，在3’末端具有poly A信号作用。 ψ+：病毒包装信号，具有指导病毒RNA包装成病毒颗粒功能。 Gag：编码核衣壳、衣壳和基质的功能。 pol：编码整合酶和逆转录酶。 env：编码包膜表面糖蛋白和转膜蛋白。 dsDNA mRNA Protein 生物的正常遗传信息流 * （二）用逆转录病毒法制备转基因动物基本步骤 构建病毒载体 转染包装细胞 收集病毒颗粒 感染受精卵 胚胎移植 表达gag, pol, env 细胞 * 逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点 优点 转基因效率高 单位点、单拷贝整合 缺点 随机整合 携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb 易产生嵌合体（mosaic) * 三、ES细胞法介导基因敲除小鼠的制备 （一）原理 将ES细胞在体外培养、扩增后，用经过改造的外源基因打靶载体导入ES细胞内，在细胞水平用正负筛选法筛选外源基因定点整合的ES细胞株。将外源基因定点整合的ES细胞注入到囊胚期胚胎的囊胚腔内，在体外短暂培养后，移植到假孕小鼠的子宫内。出生的小鼠为ES细胞来源品系和囊胚供体品系之间的嵌合体。 外源基因能否传给下一代取决于ES细胞在嵌合体动物中的嵌合程度，嵌合程度越高，ES细胞在嵌合体动物中分化成生殖细胞的可能性就越大。 * 基因打靶载体的构建 1）载体的两端有同源臂； 2）外源基因； 3）要有正负筛选基因 正筛选：Neor基因（用G418筛选，杀死未整合的细胞） 负筛选：tk基因（用Ganc筛选，杀死随机整合的细胞） tk tk 5’同源臂 3’同源臂 Neor 图11-2 打靶载体的构建示意图 * 同源臂 同源臂 外源基因 Tk基因 定点整合 随机插入 ES细胞 正常细胞 G418 + Ganc培养液 2.将打靶载体导入ES细胞内 * 正负筛选出来的ES细胞是否是我们想要的定点整合细胞，需要用分子生物学试验进行鉴定。 Southern blot试验 PCR * 3.用ES细胞介导法制作基因敲除小鼠 ♂ ♀ PCR Southern 结扎公鼠 成年雌鼠 假孕雌鼠 导入基因的ES细胞 * 将经筛选的外源基因定点整合 的ES细胞注射到囊胚内 * 4.基因敲除小鼠的建系 ♂嵌合体 ♀野生型 杂合子 杂合子 1/4纯合子 * 由于常规的ES细胞注入到2倍体囊胚获得ES细胞遗传背景的子代需要经过嵌合体阶段，使得研究成本昂贵，研发周期长。近年来发展的四倍体补偿技术可以绕过嵌合体小鼠阶段，直接获得ES细胞遗传背景的小鼠。 其方法是：将受体2细胞胚胎用电融合方法获得四倍体胚胎。培养到囊胚阶段后，将ES细胞注射到囊胚内，经短暂体外培养后将它移植于假孕第2天小鼠的子宫中。出生的子代全都是ES细胞遗传背景。其基本原理是四倍体胚胎具有明显的胚外组织限制性分布，基本不参与胎儿及胚外中胚层组织的发育。 四倍体补偿技术能显著缩短基因修饰小鼠的研发，直接得到近交遗传背景动物，大大降低了研发成本，具有明显的技术优势。 * 传统技术 必威体育精装版四倍体补偿技术 2细胞胚胎 四倍体胚胎 发育到囊胚 囊胚内注入突变ES细胞 胚胎移植 ES细胞遗传背景杂合子 电融合 确定交配 3.5天取囊胚 囊胚内注入突变ES细胞 胚胎移植 ES细胞和囊胚来源的嵌合体 嵌合体×野生型 杂合子 * ES细胞介导的转基因优缺点 优点 能在细胞水平进行筛选。 能加入、剔除或替换某个基因，或进行小到一个或几个核苷酸修饰。 缺点 ES细胞的培养条件苛刻、技术要求高，成本大。 不同ES细胞株的生殖系传播能力差异很大。 ES介导的转基因需要经过嵌合体这一中间步骤。 * 第四节 遗传工程动物的建系和保种 一、遗传工程小鼠的建系过程中的交配方式 遗传工程小鼠建系的目的是使外源基因能够稳定地遗传给后代。 转基因小鼠导入的外源基因可以在半合子状态表达，但表达的程度因整合位点的不同有所差异。 由于用显微注射法和逆转录病毒制备的转基因都是随机整合的，用同一基因构件获得的数个转基因G0代小鼠可能整合位点各不相同，且有可能多位点整合，因此G0代小鼠应该单独与该品系野生型进行交配，而不应在不同G0代小鼠之间交配。 * 基因敲除小鼠由于在ES细胞内用同源重组方法一般仅灭活一个位点，根据孟德尔的遗传法则，同源染色体的一