实时荧光定量PCR具体实验步骤.docVIP

实时荧光定量PCR具体实验步骤 以下实验步骤仅供参考：? 1?样品RNA的抽提? ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。? ②两相分离?每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。? ③RNA沉淀?将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm?离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。? ④RNA清洗?移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。?? ⑤RNA干燥?小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。?? ⑥溶解RNA沉淀?溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 ?2? RNA质量检测? 1）紫外吸收法测定? 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液?浓度和纯度。 ?①?浓度测定? A260下读值为1表示40?μg?RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260?×稀释倍数×?40?μg/ml。具体计算如下：? RNA溶于40?μl?DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260?=?0.21? RNA?浓度=?0.21?×100?×40?μg/ml?=?840?μg/ml?或?0.84?μg/μl?? 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35?μl，剩余RNA总量为：?35?μl?×?0.84?μg/μl?=?29.4?μg? ②纯度检测? RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 ?2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ?①制胶? 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10?ml的10×?MOPS电泳缓冲液和18?ml的37%?甲醛溶液(12.3?M)。?10×MOPS电泳缓冲液?浓度??成分?? 0.4M??MOPS，pH?7.0?0.1M??乙酸钠?0.01M??EDTA? 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25?μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板 放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。? ②准备RNA样品? 取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ?③电泳? 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。 ?④紫外透射光下观察并拍照? 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。? 3样品cDNA合成 ?①反应体系? 序号??反应物??剂量? 逆转录buffer??2μl? 2??上游引物??0.2μl? 3??下游引物??0.2μl? 4??dNTP??0.1μl? 逆转录酶MMLV??0.5μl? DEPC水??5μl RNA模版??2μl? 8??总体积??10μl?? 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。? ②混合液在加入逆转录酶MMLV?之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。? ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。? 4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR?? β-actin阳性模板的标准梯度制备? 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104