基因工程讲稿-5-2.ppt

第三步：应用正负选择法分离出已成功地敲除掉了目标基因的ES细胞克隆，这样的ES细胞系亦叫做突变的ES细胞。 第四步：挑选生活力旺盛的突变的ES细胞，体外注射到超数排卵的供体小鼠的胚泡中。这个过程叫做胚胎干细胞转移(embryonic stem cell transfer)。 第五步：将此胚泡移植（Transplant）到受体母鼠，亦称养母(foster mother)的子宫中。由此发育长成的当代转基因小鼠，其个体中含有一定比例的来自ES细胞的细胞群体，称为嵌合鼠。实验中所用的供体小鼠、受体小鼠和提供ES细胞的小鼠，三者均应是属于近交系(inbred line)。 三、转化载体 （一） SV40病毒载体 在动物基因工程的研究领域中，关于病毒载体方面的工作，占据着相当重要的地位。已有许多实验证明，一些具有DNA基因组或其生活史中出现有DNA阶段的真核生物的病毒，经改建后，都可以发展成为动物基因工程的载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点： ① 动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。这些启动子不但可以启动动物基因工程中常用的一些标记基因的表达，而且还能够启动克隆的外源基因的表达。 ② 有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。因此，任何插入在动物病毒基因组内的外源基因，在病毒感染之后的很短时间内，其剂量就会得到显著的增加，并实现有效的表达。 ③ 病毒具有控制自我复制的顺式元件和反式作用因子。这些病毒经过基因操作改造之后，可以发展成为能够在细胞内长时间保持高拷贝外源基因的复制型质粒载体。 ④ 有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。 磷酸钙转染技术十分有效而且易于重复，但最适转染条件的范围比较窄，为此发展出技术条件并不十分苛刻的聚阳离子-DMSO转染技术。 3．聚阳离子-DMSO转染技术 实验原理：用聚阳离子Polybrene(聚溴化季铵阳离子的商品名)处理，增加DNA对细胞表面的吸附能力；再用25％～30％的DMSO短暂处理细胞以增加膜的通透性，提高对DNA的捕获数量。 按此法测定反转录病毒DNA的转化效率，结果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加运载DNA(carrier DNA)就可得到稳定的转化。聚阳离子-DMSO转染技术的通用性尚未验证，但已知可适用于鸡胚细胞和小鼠成纤维细胞的转化。 4．基因显微注射技术 应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。 根据DNA注射的方式不同，可以把显微注射区分为真正的显微注射(true microinjection)法和“穿刺”(pricking)导入法两种。 显微注射，DNA是由注射针直接注入细胞；而在穿刺中，DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。 (1) 显微注射法 用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。如把tk-DNA注射到小鼠tk-细胞，结果有50％～100％的受注射细胞能瞬时表达胸苷激酶的活性。获得稳定转化子的数量，取决于注射的DNA的性质。 ※ 如一个对比实验，一组用pBR322／HSV-1 tk重组DNA注射，结果在500～1000个受注射细胞中，只有一个转变成稳定的转化子；另一组用连接着特定的SV40序列的pBR322／HSV-1 tk重组DNA注射，结果平均每5个受注射细胞中便有一个稳定的转化子，转化频率达20％。 穿刺法是使用显微注射针穿刺细胞及细胞核，而把外源DNA导入培养细胞或细胞核的一种特殊的显微注射法。 (2) 穿刺法 操作过程： I、取对数生长期的细胞，加入蛋白酶及EDTA溶液，于37℃下消化15分钟； II、移去消化液，并用培养基漂洗细胞之后，在每个直径为6.0cm的培养皿中接种(1～5)x103细胞，置37℃下继续培养过夜； III、在穿刺前弃去培养基，用pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)漂洗2次，然后加入浓度为5～1000μg／ml的供体DNA，覆盖于培养细胞表面； IV、对细胞进行穿刺处理； V、穿刺后，马上移去PBS—DNA溶液，换上正常培养基，随后再换上选择培养基。 5．电穿孔DNA转移技术 操作程序： 将盛有细胞和DNA混合液的特制小容器置于电脉冲仪的正负电极之间，在0℃下加高压(2.0～4.0kV)电脉冲10秒钟后，将处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再行筛选。 ※ 经过这样处理所得到的存活细胞的回收率约有60％～80％。 ※ 如果在电穿孔之前，先用秋水仙酰胺(colcemid)预处理细胞10小时，可提高转化效率3～10倍。这很可能是由于在这类中期停顿(metaphase