天然产物制备技术(戴富宝)2007.ppt

戴富宝 2007年2月 制备色谱 所谓制备色谱是指待分离的样品数量在?g与g之间，分为分析型、半制备、制备型三种。 制备色谱 对于制备型高压液相色谱分类方法有不同观点： 例如对于高压液相色谱snyder和kirkland（1979）根据色谱柱能分离样品的量将其分为分析型（多孔型吸附剂，1～2mg，15min可分开两个分辨率Rs＝1.25 的化合物，回收纯度99%）,半制备型（100～200mg）和制备型（0.5～1.0g）三种。还可增加生产型色谱，即指那些样品量在几百克到几千克之间的分离。Herbert（1991）限定制备型色谱为样品量在克数量级，柱直径在25～150mm之间的分离，而生产型色谱为所用柱直径大于150mm的分离。所以对制备型一词范围，分离样品量之间存在显著的差别。 制备色谱 选择制备型分离系统时，不仅仅要考虑待分离样品的量，还应考虑拟进行的分离的种类。充分考虑上述因素并正确选择色谱柱、尺寸、固定相种类以及流动相流速等参数才能保证分离和制备的成功。根据以往工作经验，往往采用两个步骤来完成分离工作，选用低分辨率、快速分析柱进行粗分（其中可除去色素、鞣质等杂质）再用HPLC高分辨率色谱柱进行细分。 一、基本原理 液相色谱的效能取决于分离速度和分辨率，对于制备型加压液相色谱而言，上样量是一个重要指标。 基本原理 对于某个分离参数进行优化，往往会影响其它分离参数，例如：增加洗脱液流速会降低分辨率（Rs），分辨率会因上样量过大而下降，上样量过大的原因包括样品溶液的体积过大或浓度过大，色谱柱的载样量又取决于柱的直径、长度、固定相颗粒大小以及装填的紧密程度。 对于偶尔的一次分离而言，其主要的目的是得到一定量的某个化合物，达到一定纯度和回收率。而对于生产规模的色谱分离而言，单位时间内可分离的样品量是一个关键指标，单位时间获得样品量即产量，取决于色谱柱直径和洗脱液流速等参数，生产能力和样品纯度是两个相互矛盾的因素，也就是说分辨能力并不是制备液相色谱考虑的首要因素。制备液相色谱应首先具有经济快速地生产所需产品的能力。 加压液相色谱中可发挥下列两方面的作用（a和b）或其中之一： a、加快洗脱液流速，提高分离速度，因为敏感化合物在长时间色谱分离时，其结构可能会发生变化，缩短分析时间最大优点在于避免这种变化。 b、允许在分离过程中使用颗粒度更小的固定相，获得更高分辨率。 微克级至毫克级样品一般用于波谱测试确定结构 毫克级样品可用于进一步的结构鉴定，化学反应和某些生物活性测试，克数量级样品可用于进一步生物活性测试、药理、毒理实验，作为合成或半合成工作原料及标准品。 此外，所介绍的制备液相色谱技术也可用于分离超纯标准品，标记化合物，痕量杂质，药物分解产物及代谢产物，还可用于生物高分子（蛋白质、多糖等）及多肽类化合物的分离。 二、分离方法的建立和优化 为选择制备型加压液相色谱的分离条件可采用下列操作步骤： 选择液相色谱系统。在某些情况下，可以薄层色谱分析来初步确定分离条件（Heyward和munro, 1980），即用硅胶薄层来确定正相柱条件，用反相硅胶薄层来确定反相柱条件。当选择该方法时，要牢记薄层色谱中硅胶的表面积是柱色谱中硅胶表面积的两倍，所选的展开剂条件应使样品Rf值不大于0.3 少量样品在分析型液相色谱柱上的分离。在找到适当的薄层色谱分离的展开条件后，应将该条件转用于分析型液相色谱。利用这种初步的分析来获得正确分离条件的方法可以节省时间、样品和溶剂。 操作步骤 优化分析型液相色谱条件，应寻求较小容量因子（K’），其理由在于分析型液相色谱洗脱剂系统转换为制备型液相色谱系统时，经常导致分离效能（分离度）下降。小的容量因子意味着分离时间缩短和出峰体积缩小。良好的分析型液相色谱分离通常是成功进行制备型液相色谱分离的先决条件。在找到分析型液相色谱分离条件后，通常将分离度调至高于分析型色谱所需水平。这样可以与制备型色谱分离过程中的过载相适应（图5.3）。在进行反相液相色谱分离时，增加溶剂系统中水的含量可达到这一目的。 操作步骤 操作步骤 转换至制备液相色谱系统。（Gareil 1982b；Cox 1988 ）将分析型液相色谱条件直接用于制备型液相色谱分离时，所用压力应为分析型色谱的三分之一左右（Johnson 1978）。Bidlingmeyer（1987）详细介绍了经过薄层色谱→分析型高压液相色谱→制备型高压液相色谱，来选择分离条件的方法。近期出现一种趋势，将分析型大小填料直接用于制备型液相色谱柱，这将无需对流动相作较大的改变。Waters公司生产的Symmetry系列柱（内装100ā）球形填料，即是这种色谱柱的代表。 操作步骤 纯化物质的回收。所得物质的分析，可以薄层色谱或分析型高压液相色谱进分离物质进行纯度和定性分析。分离结束后，可采