基因芯片研究--DNA探针在玻璃表面固定化.pdfVIP

基因芯片研究_一DNA探针在玻璃表面的固定化‘ 张国军1庞代文1刘笔锋： 吕应堂： (1武汉大学化学系武汉430072) (2武汉大学生命科学学院植物发育分子生物学研究室武汉430072) 关键词基因芯片DNA探针固定化 对于生命规律的认识是人类长期以来梦寐以求的愿望。生命的繁衍、进化和死亡等生命过 程错综复杂．相关研究涉及大量生物信息的同时分析处理。传统的生命信息处理方法主要是人工 操作。虽然许多生化操作和生物医学分析已有相当程度的自动化，但所需处理的信息量十分巨大， 而处理过程相互分离，信息获取周期长，成本高且使用不便，因而远远不能满足深入研究和实际 应用的需要。 DNA芯片(基囚芯片)的出现使得大规模生物信息的同时存储与处理成为现实。DNA芯片是 现代生物技术与化学和微电子技术融合的产物．其显著优点在于：分析全过程自动化，成本低， 污染小(芯片系一次性使用)，分析速度可成千上万倍地提高，同时，所需样品及化学试剂的龉 成百上千倍地减少，极高的多样品处理能力，仪器体积小，重量轻，便于携带。因而可广泛应用 于生命科学、医学、化学、新药开发、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域，是堪与计算机芯 片媲美的又一具有划时代意义的革命性技术。因此，DNA芯片技术研究是当今世界科技前沿的 重大课题，其科学价值和应用前景极其巨大。 DNA芯片制备方法基本上可分为两大类。一类是原位合成；另一类是直接点样。原位合成 适用于寡核苷酸，最具代表性的有A丘m曲讧公司开发的原位光刻合成法和另一种压印法。而点 样法是将合成好的探针、eDNA或基因组DNAi挝特定的高速点样机器人直接点在芯片上，主 要利用共价键台反应或膜吸附将DNA固定．多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸．甚至 mRNA的固定。在实际应用中，大片段DNA的固定更为重要。然而，目前在芯片表面固定DNA 探针的方法还不蟛成熟，特j；q是很难满足规模化生产的需要。所以．研究基因芯片相关的DNA 探针固定化方法显得特别重要。 1实验方法 h， 载玻片用硝酸煮沸．洗净．晾干。用2％产氮基丙基三乙氧基硅烷的丙酮水溶液浸泡2 再用1’4．苯二异硫氰酸或戊二醛处理，然后将5i端氨基修饰的24-mer寡核督酸探针固定在玻片 表面。FITC标记的互补靶序列与固定化的探针杂交后，用配有CCD的Ⅸ70型倒置荧光显微 镜成像检测。 。 2结果与讨论 图1是分别用两种不同的固定化方法，将不同量(分别倍比稀释2倍、4倍、8倍、16倍、 标记的互补靶序列杂交，用荧光显微镜成像检测的结果。对照实验所固定的为非互补24-Filer寡 核苷酸探针。从图l可看出，两种固定化方法的效果都比较好。在高浓度(至稀释2倍)时， +国家自然科学基金和湖北省自然科学基金资助。 211 分析化学的成就与挑战 两种方法盼荧光强度相差不大。而在低浓度时，用1,4．苯二异硫氰酸固定比_L}』戊二醛同定的信 号要强一些。这可能是在同等条件下，1,4．苯二异硫氰酸活化的玻片表面所固定的DNA分子的 密度高于戊二醛活化的表面。一般情况下，有机交联剂固定化方法是基于载体上的分子与溶液 中的分子之间形成共价键来实现的。而固液两相的交联反应比较复杂，其吲定化探针的实际浓 度也较难计算。我们推测．用交联法固定D1qA探针，当溶液中探针的反应浓鹰较低时，交联反 应的产率主要取决于载体表面活性基团的表面浓度；而溶液中探针的反应浓度较高时，交联反 应的产率随液相探针浓度的增大而增高，所以，在高浓度时，两}f固定化方法相差不犬。 我们还研究了DNA探针在不同的固定化时问、不同杂交时间和杂交温度、以及能检测到互 补靶序列的固定化探针的最小量等实验条件的优化，以获得最佳DNA探针同定化方法和最佳表 面分子杂交方法，为研制出可靠而实用的DNA集成诊断芯片打下基础。 t．4一苯=异硫氰酸