骨骼肌兴奋收缩偶联时钙诱导钙释放机理地研究.pdfVIP

电子显做学报J．Ch抽．Electr．Microsc．soc 19(3)；365～3662000年 365 骨骼肌兴奋收缩偶联时钙诱导钙 释放机理的研究 杨勇骥 汤莹 宋田斌昊越邰艳红 沙继宏 叶煦亭 郑尊 (第二军医大学基础部生物物理研究所，上海200433) 近年来，国外学者由生理学实验发现，在骨骼肌兴奋一收缩儡联过程中，不仅存在DCT假说， InducedCalcium 还存在钙诱导钙释放(Calcium Release，简称CICR)假说(该假说一般用于解释 心肌兴奋·收缩儡联时，肌浆网内的Ca”释放机理)。但因肌组织(包括骨骼肌与心肌)兴奋一收缩 偶联发生时的变化时间极快，达到毫秒级水平，因此目前常规化学固定(固定时间以分钟计)制样 法无法保留肌组织兴奋一收缩偶联发生瞬间时的超徽结构形态及离子(包括ca”，Na+，K+等)浓 度的变化。我们采用双向红外线探测器一计算机控制的电刺激与超低温快速冷冻固定同步技术， 对骨骼肌组织被电刺激后，在潜伏期内骨骼肌组织结构发生变化(即兴奋一收缩偶联发生的瞬间) 的同时，对其超低温快速冷冻同定，从毫秒级变化的水平获得骨骼肌组织兴奋一收缩偶联发生时 的细胞超徽结构形态变化，并对钙诱导钙释放机理进行研究。 材料与方法金属探针从螬蜍枕骨大孔垂直刺人后向前人颅内，左右搅动，捣毁其脑组织，再将 探针向后剌人椎管，捣毁脊髓，使螬蜍四肢松软。取其大腿部腓肠肌组织长约1．5cm，宽约2mm。 将取下的肌组织放人任氏液中静息约lomin，待其松弛(静息时间不能超过40min，否则收缩功 能减弱)。 将傲电报仔细地插入静息后的骨骼肌组织两螭，将其放在经过改装后的Reichert—Jung KF80(Leica公司生产)快速冷冻仅的弹射架上，由金属(铜)镜面接触生物组织冷冻，再让其静息 30min。采用“无冷冻防护剂保护的生物组织超低温快速冷冻固定法”，骨骼肌组织不作任何化学 固定，不用任何冷冻防护剂，使在最接近生理状态下进行超低温快速冷冻。 当放有完全舒张、待冷冻骨骼肌组织的冷冻仪弹射架弹射到第一对红外探测器l，双向红外 探测器(自研)提供一路脉冲数字信号传至计算机(AsT386型)，由计算机控制刺激仪产生电刺 激脉冲对骨骼肌组织进行电刺激。并用自研的毫秒级处理软件对电刺激一冷冻固定开始时间进行 定时。刺激参数为：单魅发；脉冲触发电位2V；波宽9．2ms。骨骼肌组织被弹射至已由液氯预冷到 一193℃的金属铜块上快速冷冻固定，与此同时，第二对红外探测器2传送第二路信号至计算机， 由软件对整个时间进行计算，得到骨骼肌组织被电脉冲刺激后的经历时间。经历时间必须控制在 小于2ms。将超低温快速冷冻固定后的骨骼肌组织迅速转穆到Lecia—EM—AFC冷冻置换仪 (Leica公司生产)中进行冷冻置换，冷冻置换液为巳预冷至一80℃的丙酮，置换温度和时间为： 一80℃38h；一60℃24h}一20℃6h；4℃1h，升温至l5℃(室温)后，换3次纯丙酮，每次间隔 lOmin。采用Spurr低粘度树脂包埋剂包埋，在树脂包埋剂1：1浸透样品及纯浸透样品时分别采 loommol的草酸溶液代替蒸馏水，以使超薄切片直接人草酸而使其Ca”得到原位固定。采用 基盒珥目t目塞自拣科学基盒蹙助项目(批准号 覃…一再1『 电于显赣学报J．Chin．Electr．Mic∞sc．soc 366 19(3)}365～3662000年 行形态观察分析。 结果 由计算机控制骨骼肌电蒯激后的经历时间为o．8ms。经草酸固定后的骨骼肌超徽结构形 态像及Ca2+分布表明：在骨髂肌收缩潜伏期内小于2ms时，T一管外有Ca”分布(圈1)。图2是骨 嚣肌T一管外钙离子的EDS谱峰。 讨论近年来有报道：在骨骼肌兴奋一收缩偶联过程中，不仅存在DCT假说，还存在钙诱导钙释 Inducedca】cjum 放(Calcium Release，简称c1CR)假说(该假说一般用于解释心肌兴奋一收缩儡 联时，肌浆喇内的Ca“释放机理)。该候说认为：在骨骼肌兴奋一收缩偶联