基于定量蛋白质组学棉花耐涝渍基因鉴定.pdfVIP

基于定量蛋白质组学的棉花耐涝渍基因鉴定 周仲华王 丽 郑顺利王 峰陈金湘 湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128 摘要：棉花营养液漂浮育苗是一种全新的育苗技术，是由传统的旱生育苗环境转变到水生育苗环境的 一种育苗方法。在这项技术的研究、应用及推广过程中，我们发现不同品种存在漂浮育苗适应性差 异。iTRAQ(同位素相对标记与绝对定量技术)技术是一种新的定量蛋白质组学技术，相对传统的双 向电泳技术及差异凝胶电泳技术，它具有定量更准确、重复性好、可同时标记4个样品的优势。利用 棉花营养液漂浮育苗技术平台，通过全新的定量蛋白质组学方法，鉴定棉花漂浮育苗适应能力相关的 棉花耐涝渍基因，对棉花漂浮育苗技术的推广应用具有重要的理论与实践意义，能为培育漂浮育苗适 应性强的品种提供理论依据，也能为棉花耐涝渍转基因育种奠定基础。 本研究首先对30个典型棉花品种的漂浮育苗适应能力进行了综合比较分析，筛选出漂浮育苗适 应性强、弱的品种各1个。采用漂浮育苗、传统营养钵育苗两种育苗方式对两个品种进行育苗，苗期 为3叶1心时，取其根系液氮速冻后放入-80℃冰箱中保存备用，采取丙酮沉淀法提取4个棉花材料 根系蛋白质，用GE公司的2Dquantkit进行蛋白定量，然后对蛋白质进行酶解，再用iTRAQ试剂标 记肽段并进行等量混合，然后对混合后的肽段进行强阳离子交换色谱分离，再进行液相串联质谱鉴 定。利用棉花转录组预测蛋白数据库和Mascot软件进行蛋白质鉴定，并依据蛋白丰度水平，当差异 倍数达到1.5倍以上，且p-value值小于0.05时，视为差异蛋白。在此基础上，对鉴定到的差异表达 蛋白进行GO分析、COG注释分析和Pathway代谢通路富集分析。 本项研究通过质谱共鉴定肽段62323个，蛋白1681个，所有肽段匹配误差控制在10ppm以下， 但由于棉花基因组序列测定工作2012年才完成，棉花基因组学研究相对滞后，功能已知蛋白数量不 多，因此鉴定肽段序列覆盖率相对其他模式生物偏低，都仍然有超过30％肽段的覆盖率在10％以上。 本研究鉴定到棉花其中大部分蛋白分子量在10-100KD，还有14％蛋白的分子量大于100KD，而这些 大分子量蛋白通过双向电泳等常规蛋白质组学方法往往很难鉴定。 本研究依据蛋白丰度水平1.5倍这一定量差异阈值，共鉴定差异表达蛋白510个，对于这些鉴定 的差异表达蛋白的GO功能注释分析结果表明，有大约25％的蛋白与代谢过程有关，有大约24％的 与细胞过程相关，最重要的是，有大约12％的蛋白与细胞适应刺激反应有关。而就分子功能而言，有 近50％的蛋白具有催化活性，44％的蛋白具有结合活性，说明鉴定的蛋白几乎都具有功能活性。 本项研究对鉴定到的差异蛋白质和COG数据库进行了比对分析，预测这些蛋白质可能的功能 并对其做功能分类统计，发现鉴定的差异蛋白大都可以归入能力代谢与转化、氨基酸运输与代谢、糖 运输与代谢、翻译、核酸结构与功能、翻译后修饰、信号肽等类别。 本研究对所鉴定的差异蛋白还进行了Pathway代谢通路富集分析，共发现51个Pathway与棉 花营养液漂浮育苗适应能力相关，比如有5个差异蛋白都涉及TCAcyclePathway。 总之，经过上述生物信息学综合分析，基本确定了Subtilasefamilyprotein、alpha/beta-Hydro- lasessuperfamilyprotein等6个与棉花水浮育苗适应性高度相关的棉花耐涝渍关键基因，目前正在 进行表达验证及后续的功能分析。 关键词：棉花；耐涝渍基因；蛋白质组学；iTRAQ