鸡传染性支气管炎病毒我国地方分离株S1基因5%27端变异研究.pdfVIP

生量查焦量量芏叁查塞芏壁垒墨±选生主受盟垒堡塞墨 鸡传染性支气管炎病毒我国地方分离株 S1基因5’端的变异研究+ 任涛廖 明 罗开健 曹伟胜 辛朝安 (华南农业大学动物医学系，广州510640) ； ，姣 目的片段，将其插入载体pMD 18一T中，在大肠杆菌中实现目的基因的克隆淞f克隆的目的基因经限制性酶切分析 分别为29．6％、84．1“，其推导氨基酸序列同源性分别为9．4“、82．8％。 ·关t调呜传染性支气管炎病毒分离株sl基因变异、 t ’i 、 鸡传染性支气管炎(Infectious Br。n— chitis Virus，IBV)引起鸡的呼吸道、泌尿生殖系统甚至消化系统的一种急性、高度接触性传染 病口“]。IBV血清型多，不同致病型毒株问的交叉免疫作用极弱。近年来，肾型、腺胃型等IB的出现 为本病的防治造成了更大困难o“]。目前国内外的研究者都集中精力研究IBV流行变异的分子机 制．理有的研究工作业已不断证明，病毒基因组RNA的点突变、插入、缺失和不同毒株间的基因重 组是造成IBV变异的主要分子基础[5Ⅷ。本研究采用中国不同地方引起IB流行的分离毒株与 GtnBank中发表的不同参考株sl基因(Spikeprotei“gene)，5’端核苷酸序列的同源性进行对比 分析，旨在为分析中国IB流行变异的程度和变异机制提供证据，也为预防和控制该病提供理论指 导。 1材料与方法 的不同鸡场。 1．2 sPF鸡胚购自广东省生物药厂。 1．3 工具酶及试剂 反转录酶为GIBCOBRL公司的suPERscRIPTTMⅡ；PfuDNA聚合酶购 自上海生工生物工程有限公司{限制性内切酶及RNA酶抑制剂、dNTP、载体质粒pMD18一T等均 购自宝生生物(大连)工程有限公司；其它试剂均为国产分析纯产品。 1．4引物 AA— GGAccG— cAcAcAc3’，位于起始密码子前42～65个碱基处，下游引物为：5’AccTTGAAGA 一83— 主垦查丛量匡芏叁苎煎呈笪叁蔓±壅呈垄盟i±童堡皇整 1．5 IBV基因组核酸提纯sPF鸡肛扩增的IBV各个分离株，超速离心浓缩后经蔗糖密度梯度 离心纯化，用QIAGEN公司的病毒RNA抽提试剂盒提取基因组RNA。 1．6 IBV sl基因的克隆与鉴定IBvs1基因的RT—PcR扩增参照等方法进行。将扩增的PcR 产物插入pMD18-T载体中，在大肠杆菌中实现目的基因的克隆，对克隆子进行酶切和PcR鉴定 后进行双脱氧链终止法测序。 1．7 IBV分离株s1基因5’端核苷酸序列测定及其与Hl20、Gary、Holte和sD—l／97相应序列 的比较以双脱氧链终止法测定各个IBV分离株的5’端高变区核苷酸序列，同时与GenBaDk中 H120、Gary、Holte和sD—l／97等参考毒株的相应序列进行同源性分析比较。 2结果 2．1 目的基因的RT—PcR扩增、克隆与鉴定用所设计的两对特异引物分别成功地扩增出HaN一 1／95、HaN一2／95、Gx一1／98 约l_8kb的目的片段。4个分离株的重组质粒的酶切外源片段的大小、特异性引物PcR产物均与 预期值一致。 2．2 2％和97．9“，99．5％，其推导氨基酸序列同源性分别为99．1％、98．9％、96．9％．99．2％。 2．3 与Holte、Gary株的核苷酸序列同源率分别为99．5“和76．4％，其推导氪基酸序列同源性分别为 98．9％、70．3％；从96lbp处至11 1％，其推导氮基酸序列同源性分别为9．4％、82．8％。 3讨论 3．1 IBv不同毒株间s1基因的核苷酸序列变化幅度非常大，其机制涉及点突变、缺失、