蝗虫痘病毒ELISA的建立和痘病毒间血清学关系的研究.pdfVIP

282 走向二十一世纪的中国昆虫学 蝗虫痘病毒ELISA的建立及痘 病毒间血清学关系的研究+ 覃晓春 李永丹 赵朝阳 王丽英” (中国农业大学昆虫学系．北京100094) 擅要 用提纯的亚洲小车蝗瘟病毒(0BEPv)的病毒粒子免疫家兔制备抗血 清，阻此抗血清提取I面，用晦联免疫吸附技来捡测亚洲小车蝗瘟病毒的病毒粒子， 景低检出量为l一个包涵体／rid装解释放的病毒粒子。并用此技术研究了亚洲小车蝗 关系，姑果表明OaEPV精毒粒子的抗血清与OaEPV病毒粒子、CIEPV病毒粒子、 ?DkEPV病毒粒子均有明显的免疫反应，但反应强度不同，依次减弱，说明此三种痘 ． 病毒的病毒粒子具有相届的抗原，由此可见，OaEPV与CiEPV的亲缘关系较近，而 ’ 与DkEIW的素缘关系较远。 关t词 蝗虫痘病毒 酶联免疫吸附技术 血清学 昆虫痘病毒分为三个屑。即A属(鞘翅目昆虫瘟病毒)、B属(鳞翅目和直翅目昆虫病病 毒)、C属(双翅目昆虫痖病毒)。其中B属痘病毒发病快，致病力较强，有应用潜力。蝗虫 痖病毒即属于B属，有可能研制成生物杀虫剂，成为中外学者研究的热点。近年我国叉发现 了多种蝗虫痖病毒，这些痖病毒间亲缘关系的研究具有非常重蓦的意义，不仅可以为探讨痘 病毒种的遗传与进化积累资料，而且为寻找高毒力毒株，拓展蝗虫痘病毒的防治范围提供必 研究，认为其种问存在50％左右的同源性。但对我国现有的几种蝗虫痘病毒的亲缘关系，尚 未有人研究。 酶联免疫吸附试验(ELISA)是把抗原一抗体的免疫反应同酶的高效催化作用有机结合起 来的血清学技术．具有灵敏度高和特异性强等特点，被广泛应用于病毒检测及病毒血清学等 多方面的研究。本实验即是运用此技术建立了亚洲小车蝗痘病毒(OaEPV)的ELISA检测方 法，并应用此方法探讨了亚洲小车蝗痘病毒(OaEPV)与意大利蝗痖病毒(CiEPV)、红颈戟 纹蝗痘病毒(DkEPv)的血清学关系。 1材料和方法 ．：曼謇痒彗，学基垒赍助q 遗传生理生化 1．1抗原的恻鲁 1．1．1OaEPV，CiEPV和DkEPV包涵体的提取与纯化 分别研磨感染病毒的虫尸，双层纱布过滤，1500rlam，离心10分钟。倒击上清，沉淀用 水重悬。反复离心多次，获粗提纯包涵体。将65％、61％、58％、50％(W／W)四个蔗糖梯 度，从高浓度至低浓度依次加人离心管，各梯度间形成清晰界面，4℃静置过夜。将包涵体粗 提物加于蔗糖梯度上面，在Beckman 58％与61％界面处的褐色带，加蒸馏水稀释，2000rmp离心洗糖两次．每次15分钟，即得到 纯净包涵体。 1．1．2OaEPV病毒粒子的提纯 取2×109个纯化包涵体，加包涵体碱性裂解液4ml，搅拌均匀，置30。C水浴．从20分钟 起，光镶检查，当90％包涵体裂解时(约30分钟)，迅速置于冰浴中，终止碱解，冷却后保 留上清。将含有病毒粒子的上清，加到已平衡好的蔗糖梯度上(55％，50％，45％，40％)，在 Beckman 糖，所得沉淀即为提纯的病毒粒子。 1．1．3OaEPV病毒粒子纯度检测 将提纯后的病毒粒子在透射电镜下检测其纯度及完整性。然后，将提纯的病毒粒子在 盐水稀释10倍，在BeckmanDv一8B型分光光度计上，测其紫外吸收曲线。 1．2抗血清的制鲁 以提纯的OaEPV病毒粒矛作为抗原，免疫健康的雄性家兔，将抗原与等量的福氏不完全 佐剂混合，进行皮下免疫，每周一次；共3次，抗原总量为12rag。第6周耳静脉取血测其效 价，于效价最高时颈动脉放血．收集血清，分装小瓶内，一20C冰箱中保存备用。 1．3免疫球蕾自(培G)的制备 收集白色沉淀。沉淀溶解在2m10．01M PBS(pH7．4)中，电磁搅拌下加入2rid饱和硫酸铵溶 PBS中 液．继续搅拌30分钟，静置1小时后同上离心并收集沉淀。将沉淀溶解在0．5m／0．01M 4℃下．6，000rpm离心10分钟，上清为T一球蛋白液，拎储备用。 NaO