二次通用旋转组合设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系.pdfVIP

园 艺学报201l，38(增刊)：2578 http：／／删alas．ac．cn ActaHorticulturaeSinica 26．corn E-mail：yuanyixuebao@1 应体系 谈 敏1，张其安2，，刘童光1，，江海坤2 (1安徽农业大学园艺学院，合肥230036；2安徽省农业科学院园艺研究所，合肥230031) 二次通用旋转组合设计是在正交回归组合设计的基础上发展而来，具有旋转性，能使与试验中 心点距离相等的试验点上的预测值方差相等，易于得到组合的最优反应体系。本试验中应用二次通 用旋转组合设计方法，对得到的数学模型进行分析，以期获得最佳的辣椒SRAP反应体系，为辣椒 的分子研究提供技术参考。 参试辣椒材料均由安徽省农业科学院园艺研究所提供。品种‘H．119’用于SRAP．PCR反应体 系的优化研究，18个自交系用于SRAP．PCR反应体系的检验。PCR反应程序为：94℃3mill；94℃l 1 min。35℃lrain，72℃1．5min，5个循环；94℃lmin，5012rain，72℃1．5min，33个循环； 72℃7min，4℃保存。PCR产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，100V恒 电压电泳2．5h。按条带数、清晰度及背景对32个组合设计的电泳条带进行打分，取2次得分的平 均值，应用DPS数据处理软件对结果进行分析。 0．359X3Xs+0．203X4Xs。 方差分析结果表明，回归方程显著性检验R=3．39在0．1水平上差异极显著，但是失拟检验^= 12．17在O．1水平上差异极显著，说明未控制因素对试验的影响很大，回归模型与实测值不能较好地 拟合，所以不能直接用模型进行优化分析。为此，采用计算机对不同水平的组合进行模拟试验，以 零水平的均值7．94为临界值，获得大于临界值的方案2602个，在95％的置信区间均值大于7．94的 mmol·L～，dSZPs(X3) 优化方案为：raq聚合酶(X1)用量0．465～0．49U，M92+(x2)2．264—2．298 0．189—0．211 mmol·L-1，引物(X4．)0．789～0．8ll ng。 U，MgZ+ 结合实验室移液枪的实际条件，将优化方案定为：在lo¨L反应体系中Taq聚合酶用量o．5 浓度2．3mmol·L．1，dNTPs浓度0．2mmol·L一，引物浓度0．8 ng。进 Imaol·L_1，模板DNA用量45 一步将18个不同的辣椒材料用不同引物组合对优化体系稳定性检验，结果表明该体系可靠稳定，适 用于辣椒SRAP分子标记的研究。 关键词：辣椒；二次通用旋转组合设计；S黜心；反应体系 i)S一2578-01 中圈分类号：S641．3 文献标识码：A 文章编号：0513．353X(201 投稿日期：2011一∞一眈 ·通信作者(FAmil．-也叫鹊i舡劬@yah∞．姗；Tel：0551-5160817)