黄萎病菌诱导海岛棉全长cDNA文库构建和EST分析.pdfVIP

黄萎病菌诱导海岛棉全长cDNA文库构建及EST分析 ConstructionofaFull-lengthcDNALibraryInoculatedbyVerticillium dahliaeinGossypiumbarbadenseandAnalysisofEST 张 艳丁泽国马 清 王省芬李志坤张桂寅 吴立强吴金华王国宁，马峙英 教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室/河北省作物种质资源重点实验室， 河北农业大学，保定 071001 摘要：棉花黄萎病是一种毁灭性病害，严重影响棉花产量和纤维品质。应用抗病品种是防治黄萎病最 经济、有效的措施。目前，人们对棉花抗黄萎病机理的了解还不十分清楚，且现有栽培陆地棉中缺乏 高抗抗源，因此棉花抗黄萎病育种进展较慢。棉花基因组庞大而复杂，深入挖掘棉花抗病基因、研究 抗黄萎病机理对于棉花抗病遗传育种具有重要意义。 全长cDNA是功能基因组学和比较基因组学研究的基础，也是基因克隆的重要方法之一，尤其 适用于复杂基因组的非模式植物，它是目前发现新基因的重要工具。近年来，cDNA文库构建技术已 在香蕉、大豆、菜豆等中被广泛用做分离鉴定新的功能基因。因此，要克隆棉花中一些重要基因，最好 的途径是构建代表特定时期全部细胞表达信息的cDNA文库，并从中筛选相关基因。 本研究利用高抗黄萎病的海岛棉Pima90-53为材料，采用无杂菌、全程可视化定量法接菌，构建 了黄萎病菌诱导下的根部全长cDNA文库，并对其进行了质量鉴定和EST序列分析。结果表明，文 库的重组率为92.3％，库容量为1.1×106pfu·mL-1，平均插入片段约1.8kb，是一个高质量的cD- NA文库。随机抽取50000个克隆测序，获得46192个高质量的EST序列。所有EST拼接出28329 个Unigenes，其中包括1981Contigs和26341Singletons，表明文库冗余度较低，囊括了大量低丰度 表达的基因。 生物信息学分析表明，28329个Unigenes可以覆盖289个KEGG代谢路径，其中筛选到3027个 与已知抗病功能基因同源的Unigenes，这些基因可以进一步划分为参与初级免疫系统(PTI)、效应分 子诱导的免疫系统(ETI)、Ca离子通路、氧化迸发、PR蛋白、细胞壁合成与修饰、植物激素调节及转 录因子调节。本文库共筛选到58类棉花转录因子，其中表达丰度较高的类别为NAC、G2-1ike、 MYB、BHLH、bZIP、ERF、C3H和WRKY家族。 对文库筛选获得的部分基因进行Real-TimeRTPCR分析，结果显示海岛棉Pima90-53中 PR10、BetV1、Chitinases、MLP-like、BAK和MPK4基因可以被黄萎病菌显著诱导，其表达量较对照 相比显著增高。此外，部分基因的表达模式在抗病品种Pima90-53和感病品种中棉所8号中存在显 著差异，这些基因表现出在中棉所8号中较在Pima90-53中表达量低或者表达高峰出现偏迟。所有 上述类别基因可能是构成棉花抗黄萎病的重要遗传基础。 关键词：海岛棉；黄萎病；cDNA文库；EST分析；基因表达 Keywords:Gossypiumbarbadense;Verticilliumwilt;cDNAlibrary;ESTanalysis;geneexpres- sion