骨桥蛋白基因在鸡子宫中表达变化的初步研析.pdfVIP

ANIMAL !Q!!：∑Q垦堕丛里13，NO．1 BIOTECHNOLOGYBULLETIN 35 骨桥蛋白基因在鸡子宫中表达变化的初步研究 唐修君，陈大伟，张小燕，高玉时+，陆俊贤，葛庆联 (中国农业科学院家禽研究所，农业部家禽品质监督检验测试中心，江苏扬少H225125) 引言 ．．随着．分子生物学技术的不断发展，人们认识到蛋壳形成的变化是由其自身基 的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白。研究显示，OPN在蛋壳形成过程中，可作为方解 石晶体生长的抑制剂，从过饱和的子宫液中调节碳酸钙沉积速度。本研究为了从 基因表达角度分析蛋壳形成的分子机理，以海赛克斯蛋鸡为试验素材，采用实时 荧光定量PCR技术对与蛋壳形成有关的骨桥蛋白基因在子宫中不同时间段的表达 丰度进行研究。结果表明，蛋进入子宫前2h至蛋进入子宫后5hOPN表达量逐渐升 高，蛋进入子宫后l5h至产蛋后2 h又逐渐下降，这一规律性的变化与蛋壳的钙化 密切相关，对阐明蛋壳钙化形成的分子机理、调控蛋壳质量具有重要意义。 材料方法 随机选取32周龄健康的海赛克斯蛋鸡60只，按常规方法饲养管理，连续30d观 察产蛋情况，找出每只鸡产蛋规律。分别在蛋进入子宫前2h、lh，蛋进入子宫后 5h、15h，产蛋后1h、2h采集子宫组织，迅速投入液氮冷冻，每个时间点采集6个 样品，试验鸡种来自国家家禽生产性能测定站。用Trizol法提取总RNA，经琼脂糖 凝胶电泳检测，并测定其浓度。将得到的各样品RNA进行反转录，以看家基因B． actin弓I物扩增验证反转录是否成功，以验证后的反转录产物为模板，分别用特异 引物和看家基因进行ImPCR扩增。根据Genbank上已发表的OPN(U01844)序列 设计引物， GGGAAA TGGAGA3’。利用Primer5．0设计引物，由上海生工生物公司合成。Trizol试剂、 上海生工生物公司。数据均采用SAS9．0进行方差分析。 结果 总RNA经紫外分光光度计D：渤。和D：。钿。检测其质量和纯度，得到各组样品 D：制：蚰均在1．802．02_间，纯度较好。取59L提取样品，经1％琼脂糖凝胶电泳，清 晰可见28S、18S和5S3条完整条带，说明提取的总RNA质量可靠。利用常规PCR对 样品OPN、13一actin基因进行扩增，电泳结果均为单一目的条带，与预期片段大小 相一致。由OPN、13-actin荧光定量PCR反应标准曲线可知，荧光定量相关系数值 线均符合基因熔解标准，曲线PCR产物均只有1个特异峰，无引物二聚体及非特异 性产物，OPN、13-actin扩增曲线基本符合“S”型曲线扩增要求。子宫组织中 OPN相对定量分析结果显示，OPN基因在蛋形成过程中表达量逐渐升高，在蛋进 入子宫后5h时表达量最高，之后逐渐下降。 讨论 蛋壳物质由子宫内蛋壳腺粘膜细胞分泌的子宫液沉积而成，蛋壳形成矿化过 程中存在一系列特定的基质蛋白，参与引导独特、规则的晶体沉积结构形成，因 此对蛋壳基质蛋白的认识为探讨蛋壳形成的机理提供了可能。OPN是影响蛋壳钙 化形成的重要基质蛋白，近年来，OPN基因在蛋壳形成过程中作用机理研究已进 入起步阶段。研究表明，OPN的表达是由蛋进入子宫后对子宫壁的机械刺激而引 起的。本实验运用实时荧光定量PCR技术，分析与蛋壳钙化密切相关的OPN基因 在不同产蛋阶段定量表达变化规律，进～步说明OPN基因与蛋壳钙化形成过程中 钙沉积的具体关系，并进行更为直观、准确的描述，为深入研究其与蛋壳钙化、 钙沉积的关系提供依据。 关键词：蛋鸡；骨桥蛋白基因；荧光定量PCR；基因表达 致谢：本研究由江苏省科技公共服务平台专项(BM2009908)及扬州市科技公关 (YZ2009035)资助。 车通讯作者。