PTEN基因对HHCC细胞株细胞周期和凋亡的影响.pdfVIP

PTEN基因对IfftCC细胞株细胞周期厦捐亡的影响 165 PTEN基因对HHCC细胞株细胞周期及凋亡的影晌 王知力王文亮郭双平首建新骆文静张传山 个区域经常发生缺失与突变，尤其是晚期肿瘤，如前列腺癌、胸腺癌、甲状腺癌和神经胶质瘤 胞生长、转移、浸润发挥着重要的作用。 体外的研究表明，外源性的PrEN基因可使缺乏功能性PTEN产物的肿瘤细胞生长抑 制…。但PIEN对肝癌细胞的影响。国内外尚未见报道。本研究应用脂质体介导的基因转染 其对HHCC细胞周期及凋亡的影响，以期为原发性肝癌的基因治疗提供实验依据。 材料与方法 (一)质粒与材料 B．Fumari博士赠o 质粒pBabe—Pure—PTEN和pBabe—Puro由美国FrankpBabe—Ptao— 209 FIEN质粒由一个1 I酶切位点构建 bp的FIENDNA片段插入至pBabe—Puro载体的EeoR 士德公司。HHCC细胞为本室保存培养，经原位分子杂交及免疫组织化学鉴定，此株细胞的 PIENmRNA及蛋白的表达均为阴性。 (二】基因转染 克隆形成。 (三)鉴定 基因及蛋白的表达，以鉴定转染是否成功。原位分子杂交及免疫组织化学的方法参照试剂盒 操作说明进行。 (四)MTr试验 将三组细胞制成细胞悬液，以每孔lo．个细胞接种于96孔培养皿中。培养2—3d后，以 基金项目：国家自然科学基金资助项目(300076) 作者单位：710032西安。第四军医大学病理学教研室 166 中国癌症研究进展@ nnml／ nmol／L，0，5nnM／L，1nmol／L，2 A匙q诱导各组细胞凋亡。A％q的浓度梯度分别为0．25 L，4nmol／L。每组细胞的每一药物浓度为三个孔。培养鹌h后，吸弃药液，加人rer(5 n,．g／m1) h，加人二甲基亚枫150 rain，酶联免疫检测仪上测定各孔在 20阻，孔作用4 m／孔，振荡10 490 m波长处的光吸收值。 (五)细胞周期分析 m叫L)来诱导凋亡(以 将未转染PIEN基因和转染了F1EN基因的细胞分别加入Aszq(1 mol／L乙醇固 未诱导凋亡的HHCC细胞为对照)，培养48h后，分别收集l旷的各组细胞，750 定。检测前离心去乙醇，加入250mg／L碘化丙锭(PI)O．2盯d，暗处放置30rnin，进行流式细胞仪 检测，测定细胞周期，观察是否存在凋亡峰。 I六)透射电镜观察 上述处理细胞的同时，收集各组细胞。细胞经rtts(o．01 mml／L，pH7．4)浸洗2次后，3％戊二醛 固定，锇酸后固定，脱水，包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜下观察凋亡细胞。 结 果 (一)PTEN基因转染删OC细胞 原位分子杂交、免疫组织化学方法证明，转染眦N基因的HHCC细胞中PIEN基因的 mRNA、蛋白表达均为阳性。阳性信号位于胞质中，呈棕黄色颗粒。表明外源性P删基因已 整合人HHCC细胞并表达。