高血压致心脏纤维化和脂联素保护作用机制研究.pdfVIP

_Ill 高血压致心脏纤维化及脂联素保护作用机制研究 …………………………………………………………………齐冠鸣(导师杜杰) 【摘要】背景 高血压病全球范围内发病率呈现逐年上升的趋势。高血压导致心脏重塑的病理特点是心肌细胞肥大及 心脏间质纤维化，而心肌纤维化是心脏功能衰竭(HF)的主要原因。肾素一血管紧张素II一醛固酮系统(KAAS)系统激 II)水平增高，是高血压导致心脏纤维化的最为主要原因。活化的成纤维细胞通过分泌细 活，尤其是血管紧张素II(Ang 胞外基质(ECM)促进胶原沉积及纤维化损伤。近来研究显示炎症反应在组织纤维化进程中起到重要作用，而血管紧张素 Ⅱ可以作用于炎症细胞活化招募过程中的重要阶段。脂联素(APN)具有抗炎及抗氧化作用。在高血压、糖耐量异常及血 脂紊乱状态下循环中的脂联素浓度明显下调。自噬过程可维持细胞营养状态，而自噬功能异常可导致多种病理状态。本研 究采用肼苯哒嗪进行血压调节，以脂联素基因缺陷小鼠作为研究对象，着力于血管紧张II如何触发心脏炎症反应的早期过 程。以炎症细胞活化及炎症机制作为核心环节，探讨高血压导致心脏纤维化的发病机理，寻找有效的临床干预措施靶点。 目的 通过复制高血压小鼠模型，采用病理学及分子生物学技术观察心脏组织中胶原沉积、炎症细胞浸润及炎症因子 表达；给予肼苯哒嗪干预(降低血压)治疗，进而证实动脉血压升高是心脏炎症反应及纤维化损伤的启动因素；进一步采 用脂联素缺陷小鼠复制高血压模型，明确脂联素调节细胞炎症反应的机理；结合体外细胞实验验证脂联素调节炎症细胞分 化的信号途径，为寻找有效的临床干预措施提供依据。 方法 1．研究对象分组： 第一部分实验证实动脉血压升高是心脏炎症反应及纤维化损伤的启动因素，将野生型(wT)小鼠随机分为4组 (n=10)： (1)生理盐水溶液灌注+安慰剂治疗组(Vehicle+Contr01)； (2)血管紧张素II灌注+安慰剂治疗组(AngII+Contr01)； (3)生理盐水溶液灌注+肼苯哒嗪治疗组(Vehicle+HYD)； II+HYD)。 (4)血管紧张素II灌注+肼苯哒嗪治疗组(Ang 第二部分实验论证脂联素对炎症细胞的调控作用，将野生型小鼠和脂联素基因缺陷型(APNKO)小鼠随机分成4组 (n=6)： (1)野生型小鼠+生理盐水灌注组(wr+Saline)； KO+Saline)； (2)脂联素缺陷小鼠+生理盐水灌注组(APN lI)； (3)野生型小鼠+血管紧张素II灌注组(wT+Ang (4)脂联素缺陷小鼠+血管紧张素II灌注组(APNKO+AngII)。 2．小鼠高血压模型制备：采用血管紧张素II微量泵灌注模拟高血压致心脏纤维化模型，灌注速率IS00ng／kg*min。 3．血压测量：采用尾套管(Tail—cuff)血压仪连续测定实验小鼠尾动脉血压。 4．心脏功能(CF)测定：采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能。 s．心脏组织纤维化测定：采用Masson三色特殊染色方法检测组织内胶原沉积。采用免疫组织化学染色(IHC)及 w．B．方法检测0t—sMA及TGF-B的表达。 6．心脏组织炎症细胞及炎症因子测定：采用免疫组织化学染色及KT—PCK方法检测巨噬细胞特异性标记Mac一2，以 及炎症因子IL一1 B和TNF—oto 7．心脏组织血管紧张素II及血浆肾素活性(PKA)测定：采用放射免疫分析方法(R队)检测。 8．组织自噬测定：采用免疫组织化学方法检测LC3表达，采用免疫荧光染色(IF)及激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞 自噬情况。 9．细胞培养及处理：采用密度梯度离心法分离培养小鼠骨髓源单个核细胞进行实验，采用重维球形脂联素(gad)进 行预处理。 10．细胞自噬检测：采用免疫细胞荧光染色技术及蛋白质印迹方法检i贝tJLC3表达，采用透射电镜观察细胞内自噬小体 空泡样结构的形成。 11．细胞NF-KB活性检测：采用NF-K B转录活性荧光素酶报告系统进行测定。 12