Nogo—A蛋白在HIBD新生大鼠大脑组织中的表达和其意义.pdfVIP

泛珠三角围产医学会议 会议交流 ∥Nogo--A蛋白在HIBD新生大鼠大脑组织中的表达及其意义 刘仁红’，周晓光2，黄嘉言广州医学院第二附属医院新生儿科(广州，510260) brain 目前，新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic—ischemic 然是一个比较棘手的问题，有关其发病机制和治疗尚存在许多疑点。而脑组织在缺氧缺血 性损伤后再生困难的重要原因之一是Nogo—A等抑制神经生长的因子的存在，形成了一个不 利于神经再生与修复的微环境Ⅲ。Nogo—A即是多种神经生长抑制因子之一，它在特定条件 下有抑制神经生长的作用。到目前为止，有关Nogo—A抑制神经生长的作用方式、信号传导 途径、影响Nogo—A表达的因素尚不明确，深入研究该基因在中枢神经系统的表达具有重要 意义。本研究通过建立HIBD新生大鼠动物模型，并且采用免疫组织化学染色法研究Nogo-A 蛋白在HIBD新生大鼠神经组织的表达规律及其意义，为进一步的研究奠定基础。 1材料与方法 1．1动物分组与处理新生7天的SD大鼠，雌雄兼用。种鼠由广东省实验动物中心提供。饮 食为广东省实验动物中心提供的普通颗粒饲料，自来水，室温控制在15—24℃。动物随机分 天、28天四个亚组。新生鼠建模后置于母鼠身边喂养。 1．2标本的取材与Nogo-A检测 1．2．1标本取材依照实验设计，按时将动物经心脏灌注固定，即从左心室进针插入主动脉， 同时剪开右心耳。先灌注生理盐水，流出液清亮后换为多聚甲醛。取左侧大脑半球，放入4％ 多聚甲醛溶液中后固定1天，再经10％、20％、30％蔗糖多聚甲醛溶液依次沉底后，冰冻切 片o 1．2．2 洗3次；滴加5％BSA封闭液，室温20min。3)甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗 (一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度 不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间：背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间)， 37℃1小时左右或20℃时2小时左右，也可4C过夜。PBS(pH7．2—7．6)洗2min×3次。4) min min。PBS(pH7．2—7．6)洗2 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔、人IgG)，20—37℃20 20 X3次。5)滴加试剂SABC，20-37Cmin。PBS(pH7．2—7．6)洗5 各l滴，混匀后加至切片。室温显色， 镜下控制反应时间，一般在5—30min之间。PBS洗 294 泛珠三角围产医学会议 会议交流 涤。裱片，晾干。脱水，透明，中性树胶封片。 为检验本实验的专一性和可靠性，同时用PBS代替一抗作对照，结果为阴性。 1．2．3图像采集与统计学处理各组实验鼠脑组织切片完成免疫组化染色后，统一采用M100 ， ● 像分析。每张脑组织切片均取相同位置的8个高倍视野数出阳性信号数量，算出平均数。然 后利用SPSSI 显著性界限。 2结果 2．1 后，在新生鼠海马齿状回及大脑皮质中神经元高度密集，出现较强的Nogo—A免疫阳性反应， 阳性物质呈棕黄色。高倍显微镜下可见新生鼠海马区和大脑皮质中Nogo—A免疫反应阳性物 质仅存在于神经元胞浆及突起内，而胞核为阴性。 较深，定位于皮层的第1II层。Nogo—A在海马前下托与胼胝体呈强阳性信号，并形成明显的阳 性细胞带，染成棕黄色；而在海马内的表达呈弱阳性，仅在海马的齿回见部分散在的Nogo-A 阳性神经元，染为淡黄色，而海马的其他区域则极少见到阳性神经元。 在假手术组脑组织切片中也可见到Nogo—A阳性细胞，免疫反应阳性物质仅存在于神经 元胞浆及突起内。阳性细胞散在分布，染色较淡。 2．2