H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统构建.pdfVIP

168 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建 罗琴芳毛三英牛学锋辛朝安郭霄峰+ (华南农业大学兽医学院广州510642) 摘要：根据国内外已公市的AIVH9N2亚型垒基因蛆序列设计了8对引物，分别对低致病力禽流感病毒 接。经酶切、质粒PCR、测序等结果确定，KMⅢ株的八质拉转豢系统椅建成功。将A个双向转录表达质粒共 转橐293T细胞，传代等．经血凝活性测定、RT-PCR等检测结果表明拯教的病毒具有复制和传代能力。由此， 本研究建立了HgN2亚型AIV的反向遗传操作技术平台．为禽流感病毒分子致病力的研究、病毒毒力基固结构 功能的研究、载体疫苗的研究及筛选出理想的疫苗候选株奠定了基础。 关键词：A型禽流感病毒，HgN2亚型，反向遗传技术，病毒拯救 Influenza 禽流感是由A型禽流感病毒(Avian Virus，AIV)日／起的一种严重危害禽类健康及多种动物 的传染性疾病。我国农业部和国际兽疫局已将其列为A类传染病“1。最近几年来，由H9亚型病毒(HgN2) 引起的禽流感十分普遍。据撤道，德国、意大利、爱尔兰、南非、美国、韩国、中国、中东、伊朗和 接感染人oJ。禽流感病毒反向遗传技术的出现给禽流感病毒基因组结构与功能，分子致病机理研究带 来了便利。本研究旨在尽快建立禽流感病毒的反基因操作系统，为阐明我国禽流感病毒致病力的分子 基础、抗原性变异规律和构建高效、安全的新型禽流感疫苗奠定基础。对遏制禽流感在我国的蔓延、 保护我国养禽业的健康发展及人畜公共卫生均具有重大的现实意义和社会意义．同时对学科的发展也 有重要的科学意义。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1 分离自广西某鸡场，由华南农业大学禽病实验室分离鉴定。 1．1,2栽体、主要酶类及主要试栽：双转录载体pBD由啥尔滨兽医研究所陈化兰博士惠赠；工程菌 0．5％鸡红血球采自非免疫、隔离饲养的成年母鸡，用PBS洗涤三次，最后配成0．5％的悬液。DNA I PolymeraseK]enow大片段、T4DNA聚合酶I、T4 I购自+N曲公司．RNA DNA连接酶及内切酶Sap 提取试剂Trizol KOD-plus高保真DNA聚合酶购自津美生物工程公司等。 1．2方法 5．0生物学软件辅助设计合成下列引物，见表一。 1．2．1引物设计：应用Primerpremier 作者简介： 罗琴芳(1970)．女，讲师．籍贯新疆，预防兽医学博士，主要致力于细菌、病毒分子生物学研究。 +通讯作者：Enmil：xfguo@scau．edu．cn，Tel：020 基金项目： 国家自然科学基金30440010)和广东省自然科学基金(020996)资助项目。 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 169 表一： KMⅢ株全基因组RT—PeR引物 Flu lit—primer：5’．AGCAAAAGCAGG．3’ PB2 Fw AT 5’CCAGCRAAAGCAGGTcAATT3。 BW 3。 PBl Fw 51CCAGCAAAAGCAGGCA从CCA31 Bw 5。TrAGTAGA从CAAGGCAlTTmCAT3’ 队 Fw 5’CCAGCAAAAGcAGGTACTGATcCA3’ Bw 5‘TTAGTAGAAACAAGGTAcTTlTrTGGA3’ HA Fw 5’CCAGCAAAAGCAGGGGTCCAAT3’