54例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV+cccDNA和血清HBsAg定量检测结果分析.pdf

cccDNA 54例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV 与血清HBsAg定量检测结果分析 解放军第三。二医院肝衰竭诊疗研究中心 全军传染病研究所病毒性肝炎研究室 李韦杰李伯安赵景民韩佳琪刘妍江玲毛远丽辛绍杰徐东平 closedcircular 共价闭合环状DNA(covalentlyDNA，cccDNA)是HBV复制的初始模板，其 在肝细胞内的长期存在是导致乙肝病情慢性化及停药后复发的重要因素，因此检测HBVcccDNA 具有重要临床意义，是评价HBV复制活跃程度和抗病毒疗效的重要指标。但HBVcccDNA检测 需要肝组织标本，临床应用受到一定限制。近年来血清HBsAg定量的临床意义日益受到重视， cccDNA存在相关性，可以作 应用越来越广泛。有研究表明血清HBsAg定量水平与肝组织HBV 为肝组织I-IBV cccDNA的替代标志物，但也有研究认为这两种检测指标在HBeAg阴性慢性乙肝 患者中并无显著相关性。此外，对肝组织HBVcccDNA定量与血清HBVDNA载量的相关性、 DNA载量的相关性不同研究得出的结果也存在差别。本研究收集 血清HBsAg定量与血清HBV 了54例慢性乙型肝炎患者的肝组织标本和对应的血清，进行了HBV cccDNA定量、血清HBsAg DNA载量相关性。 定量，分析了两种定量指标之间及其与血清HBV 一、材料与方法 mini 1．主要试剂：石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(FFPE kit，德国Qiagen公司)：不降解 DNA聚合酶(日本Takara公司)：引物及探针由上海生物工程公司合成。 Taq 2．研究对象：选取解放军302医院2008年1月一2010年5月期间住院的54例慢性乙型肝 安)全国会议修订的‘病毒性肝炎防治》标准，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及输血传播 病毒、巨细胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、药物性、自身免疫性肝病。在防止污染的前提下， 切取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肝穿组织切片，同一时间收集的患者血清标本由本院血清 库保存。患者基本临床资料见表1。 表1患者基本临床资料 3．血清HBsAg水平及血清HBVDNA载量检测：血清HBsAg检测采用美国Abbott公司的 ．80． 化学发光试剂，血清HBVDNA定量采用上海复星医学科技发展有限公司的实时荧光PCR试剂， 检测下限为100Ⅳ／rIll。 4．肝组织HBVDNA的提取及HBV cccDNA定量：准备FFPE肝穿组织切片样本(6pm， 5片／蜡块)，提取肝组织HBV DNA提取液，用PSAD酶消化松驰环状 DNA，从中取6．8山HBV HBV circular DNA：用phi29DNA聚合酶对cccDNA进行滚环扩增(roilingamplification，RCA)： 以RCA产物为模板，进行跨缺口引物介导的选择性实时荧光PCR反应：以IB-actin为内参照， 参照文献报道的每个细胞中含有的人类基因组DNA 6．667pg进行细胞数的计算。具体