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L-苯丙氨酸基因工程菌的分子育种 研究进展1 吴伟斌2施巧琴1,2 吴松刚1，2, 1工业微生物发酵技术国家工程研究中心{福建师范大学}福州 2福建麦丹生物集团有限公司福州研究中心 福州 [摘要]目前工业发酵生产L-苯丙氨酸的菌株均是由大肠杆菌产生的，随着近年来L—苯 丙氨酸市场需求量的增长，使得快速选育高产量遗传稳定性强的新型基因工程菌显得尤其 重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展，以及对微生物芳香族氨基酸代谢 途径的进一步了解，L-苯丙氨酸生产菌株的选育已经由原来的随机诱变筛选进入到分子育 种阶段.本文综述了L-苯丙氨酸基因工程菌的分子育种研究进展. [关键词]L-苯丙氨酸；大肠杆菌；分子育种；基因敲除 向构建一个或多个基因的突变体，并从中筛选能够表达目的产物的株系。分子 育种是遗传物质DNA重新组装的过程，与传统的菌种诱变有本质的区别。它具 有产生多样性高质量分子的能力，还町实现活性分子多样性的共同进化。同时， 它还能广泛适用于单一基因、家族性基因、单一代谢途径甚至是整个基因组层 面的体外分子定向进化。自20世纪80年代以来，科学家们已开始通过改造次 生代谢产物合成过程来进行L-苯丙氨酸基因工程菌的分子育种，其主要目标是 大幅提高L一苯丙氨酸的产量。 2提高L-苯丙氨酸产量的分子育种 L一苯丙氨酸是大肠杆菌芳香族代谢产物，通过基因工程的方法扩增表达芳 香族代谢过程限速酶的基因，敲除负调控基因，调整代谢流，基因改造获取抗 反馈抑制的关键酶基因，引入抗性基因、调节基因和血红蛋白基因等都能对L一 苯丙氨酸的生物合成代谢进行调控． 2．1L-苯丙氨酸发酵宿主菌的选择 在选择发酵生产L一苯丙氨酸基因工程菌的宿主微生物时．需要考虑以下因 素：克隆载体导入的可能性、质粒重组的可能性、环境污染、应用原料的范围． 宿主遗传背景等。目前国内外基因工程菌发酵生产L_苯丙氨酸的宿主菌均为大 肠杆菌，大肠杆菌具有生长快速，遗传学、生理学背景清楚，易于进行基因改 造等优点，而且能利用简单培养基快速生长的菌株。 2．2扩增表达L一苯丙氨酸合成代谢过程限速酶的基因 苯丙氨酸是糖代谢中间产物4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸经过一系列 反应合成的，大部分的途径与Tyr和Trp的合成途径一致。大肠杆菌中L一苯丙 氨酸的合成在许多关键点上受到调控．调控的途径多种多样。第一步被三个同功 酶催化，这三种酶分别通过转录途径被产物所调控．酶的活性也受到产物的反馈 Trp调控：合成苯丙氨酸的第二、第三个关键酶是由pheA基因编码的CM／PD酶． 它在酶生成水平和酶的活力上受到产物的调控。另外较高浓度的苯丙氨酸会引 起酶蛋白的多聚化，使得酶活力降低。L-苯丙氨酸基因工程菌的改良，也可通 过改变关键酶基因的结构从而造成对终产物苯丙氨酸的不敏感(解除反馈抑 制)，然后来分离筛选对苯丙氨酸有抗性的突变株，作为生产发酵的菌株． 1985年，Ozaki等人将抗苯丙氨酸类似物的谷氨酸棒杆菌上编码明和PD 27 i 的基因克隆进Pce53质粒，再导回亲本，发现其酸产量提高50N。Robnson等 从E．coliB菌株克隆了高效的转氨酶基因，将重组质粒转回亲株，其芳香族氨基 酸转移酶活性为亲株的10倍：1992年，Ikeda等从苯丙氨酸生产菌株中克隆了 脱酶的Ds、删及即酶基因．并将它们串联起来．克隆到同一个多拷贝的载体上。 转移到色氨酸生产菌株中．使代谢流向产苯丙氨酸方向转移，产酸289／l：1993 年．Ikeda等将完整的基因克隆入穿梭载体中，并导入棒状杆菌中表达，实现了利 用异源的酶在棒状杆菌中生产苯丙氨酸。产量239／I．1994年中国医科大学生 物技术中心的史燕东等将tyrB基因克隆质粒导入不同的宿主菌，得到产酸量提 高的菌株；1999年，复旦大学范长胜等通过将关键酶基因aroG、pheA进行串联 表达来构建生产菌株，也大幅度地提高了工程菌的发酵产量，但都未达到工业 化需求水平。Yang等通过构建了多种TyrR的突变子，并将它们导入生产菌株． 从而导致aroF、aroG、aroL和与苯丙氨酸运输和转氨基作用有关的基因等不 受抑制调控．而变为组成型表达．Zhang等将酶的三个功能结构域作了