高致病性禽流感病毒的分离、鉴定和分子流行病学研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 抗体夹心ELISA方法，采用方阵滴定法对各项反应检测结果与通过病毒分离确定的阳性样本符合率为 条件进行优化(／g括单抗最佳包被浓度、酶标多抗最 100％。 佳稀释度、封闭液的选择、阴阳性临界值的确定)。交 叉试验及人工感染鸡组织检测确定方法的特异性。 3讨论 禽流感的临诊症状变化很大，仅根据剖检和病 2结果与分析 理变化难以定性，实验室诊断对于该病的确诊非常 2．1H5亚型禽流感病毒的单抗及多抗纯化后的蛋 重要。鸡胚分离病毒是检测禽组织中AIV的一种经 白含量经硫酸铵盐析法和DEAE一纤维素柱层析典、准确、敏感的方法，但因耗时长而不利于AIV的 快速诊断，病毒捕捉ELISA技术以其成本低廉、操 提纯的单抗和多抗浓度分别为1．4mg／ml和3． 5mg／ml。 作简便、快速等优点成为现场诊断的理想选择。本研 2．2双抗体夹心ELISA方法的建立根据试验条件究在制备出重组H5亚型AIVHA蛋白的多抗及单 的摸索，最终确定单抗最佳包被浓度为50pg／ml，酶抗的基础上，摸索并确定了最佳反应条件，建立了以 标多抗工作浓度为1：200；最佳包被条件为37℃1h单抗捕获、酶标多抗结合的双抗体夹心ELISA反应 加4℃过夜；用1％BSA做为封闭液，37℃封闭2h；体系，用以检测H5亚型AIV感染的组织样本。通 待检抗原最佳稀释倍数为1：5；加入待检样品后的 过对人工感染鸡病料的检测证实了该方法具有较高 反应时间为1h，加入酶标多抗后的反应时间为1h，·的特异性和敏感性，且操作快速、简便，为及时、准确 加入底物溶液后的反，应时间为10min；当样本预报AIV疫情提供了有力的技术保证。 OD45。．．。值=0．3时判定为阳性；OD‘50mn值0．3 时判定为阴性。 参考文献 S，StivanandanV，N V，et E1]Kodihalli agaraja a1．Antigen-- 2．3双抗体夹心ELISA反应程序的确定单抗包被 fordetectionofavianinfluenza capturee眦ymeimmunoassay 一洗涤一封闭一加待检样品一洗涤一加酶标多抗一 virusin Vet 1385～ turkeyslJ]．AmJ Res，1993，54(9)l 洗涤一加底物一终止反应一用酶联仪测OD伽值一 1390． 结果判定。． R a1．Evaluationofa [2]ZhouE—M，ChanM，HeckertA，et ELISAfordetectionofantibodies 2．4特异性检验采用确立的双抗体夹心ELISA反competitive againstavian influenzavirus vian 517 应条件，用H5、H7、H9亚型AIV和新城疫病毒、法 nucleoprotein[J]．ADis，1998，