鸡传染性法氏囊病病毒Gt株全基因组分子标签引入.pdfVIP

中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 鸡传染性法氏囊病病毒Gt株全基因组分子标签的引入 祁小乐1’2，高宏雷1，王笑梅p，余力1，高玉龙2 1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨，150001： 2．中国农业科学院研究生院，北京，100081 病之一。本研究设计了一套高效、快捷的突变方法，仅需设计一对引物，做一次PCR，既可引入感兴趣的突 变，可单点突变，也可多点突变，对基因功能的研究十分有用。本研究仅通过突变一个核苷酸(沉默突变)， 分别在IBDV 的PstI酶切位点，作为IBDVGt株全基因组的分子标签。经过酶切鉴定和测序分析，证明在IBDVGt株 子标记疫苗的开发奠定了基础。 关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV)Gt株沉默突变分子标签 Bursal Bursal 鸡传染性法氏囊病(Infectious Disease 器官一法氏囊。淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞是主要的靶细胞，从而导致免疫抑制，降低机体对其它传染 法氏囊病病毒(IBDV)均为低毒力毒株，引起鸡的死亡率低于2％，应用疫苗控制该病取得了满意的效果。但 从1987年起，世界各地均有免疫失败的报道。90年代以来，出现了毒力大大增强的法氏囊病毒超强毒株， 常常使感染鸡群出现全群覆灭的惨痛局面(死亡率高达70％以上)，这是直接的危害。间接的危害是破坏法 氏囊组织，导致免疫抑制，使鸡对其他病毒病和细菌病的易感性增高，同时影响新城疫、马立克氏病等的 免疫效果，也使IBD本身免疫经常失败。该病在我国的流行也十分复杂。本病已成为长期以来动物病毒研 究领域的热点之一n’53。 因功能，必须借助反向遗传操作技术(reverse 操作技术的基础。基因组中分子标签的引入是拯救病毒和反向操作以及后续研究的必要工作。在感染性克 隆中引入沉默突变，即改变一个或几个不影响表型的核菅酸使之区别于原有的野生型病毒序列，这称为遗传 标记，又称为分子标签，使得在检测子代病毒时有充分的证据表明确实是病毒获得拯救而不是受到野生病毒 的污染㈦3川。 Gt株全基因组中引入分子标签，为以后IBDV反向遗传研究以 本研究旨在通过沉默突变的方法往IBDV 及分子标记疫苗的开发奠定基础。 1材料与方法 1．1病毒 IBDVGt株由哈尔滨兽医研究所免疫抑制病研究室致弱并保存。 1．2菌种和质粒 基金项目：国家973项目“动物重大传染病病原变异与致病的分子机制”(2005CB523202)资助。 作者简介：祁小乐(1980一)，男，河南宜阳人，在读博士生，主要从事动物病毒学研究。 通讯作者：王笑梅(1962一)，女，研究员，博士生导师。E-mail：．xmw@hvri．ac．cn 119 中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 由免疫抑制病研究室构建。 1．3工具酶与主要试剂 各种限制性内切酶，Pyrobestl”DNA M-MLVRTasecDNA Synthesis 海华舜生物工程有限公司；其它试剂为商业公司购买的分析纯产品。 1．4重组质粒pUCl8GtA和pUCl8GtB的鉴定 1．4．1 pUCl8GtA的鉴定 1．4．1．1酶切鉴定 2u1，10×Mbuffer1 ul，EcoRll ul， 用EcoRl对pUCl8GtA进行酶切，酶切体系为：pUCl8GtA 灭菌水6ul。37。C作用2小时，于O．6％琼脂糖凝胶上电泳检测。 1．4．1．2PCR鉴定 buffer2．5 反应体系为：i0×pyrobest DNA polymerase 下游引物(10pM)lul，pUCl8GtAlul，pyrobest 于0．6％琼脂糖凝胶电泳检测。 1．4．2 pUCl8GtB的