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病毒及病毒病害
v-GAV运动蛋白的表达、纯化、
抗血清制备与检测
谢家建,王锡锋,刘艳,彭于发,周广和
(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫专生物学国家重点实验室, 北ft.100094)
运动蛋白(MP)是病毒基因编码的,介导病毒在宿主细胞间运动非常重要的蛋白。对MP蛋白定量和
在植株体内进行跟踪研究是研究其功能的重要基础。而MP蛋白在发病植株体内含量很低,很难得获得纯
化的MP蛋白。本研究将BYDV-GAV
蛋白,采用Ni柱进行亲和纯化,获得纯化的MP融合蛋白。免疫小鼠制备了抗MP血清。抗血清效价为l:
10000,并在接种发病植株中检测到MP蛋白,其含量为0.5.1岖胞鲜重叶片。
1 MP基因的克隆和表达载体的构建
(下划线为NdeI 和 MP2:
5-GA!坠蟹幽三GCCa认GGAGAGCAAGG.3‘ 酶切位点)
kDa,表达的融合蛋白是在完整的MP
的MP基因全长为462bp,编码154个氨基酸,理论分子量为17.2
子量为19.7kDa。
2 MP融合蛋白的表达和纯化
分别接种鉴定阳性的单菌落于4mL的含100
extract,and
1.0%NaCl,pH7.O)中。37℃培养8.12
达带,而空载体和未诱导的阳性克隆则没有(Fig.1),将表达量高的单菌落用于大量表达。
1L含100 mM的IPTG
I.tg/mL氨卞的LB液体培养基中。37℃培养使OD600达到约0.6时,加入至终浓度0.4
Buffer
进行诱导,28℃诱导8hr。培养菌液12000 A(50raMsodium
rpm离心20min,沉淀用50mL phosphate
buffer
pH7.4,500mMNaCI)悬浮。采用超声波破碎菌体,进行溶解性分析,结果表明表达的可溶性MP蛋
用于表达蛋白的纯化。
大量纯化时采用3种不同的溶液进行纯化,先分别采用不含咪唑和含lOOmM咪唑的BufferA洗脱杂
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蛋h川信500mM的麟I啡沈脱Hn7』蛋亿透析后崔臼浓他删定为f)28
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