胃癌易感性基因检测芯片研发和临床初步应用.pdf

第一届上海生物芯片与消化道肿瘤研究论坛 胃癌易感性基因检测芯片研发与临床初步应妇 于莲珍施瑞华胡莺郜恒骏 南京医科大学第一附属医院消化内科210029 生物芯片上海国家工程研究中心201203 胃癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一，发病率有逐年上升的趋势。近20年来，很多学者 致力于胃癌病因学研究，发现胃癌的发生是多因素综合作用的结果，与遗传背景、感染和环境因素等均有关 系。最近的研究结果为遗传因素与胃癌的联系提供了进一步可靠的依据，IL一1B基因的单核苷酸多态性 nucIeotlde (single ology上发表的成果说明幽门螺杆菌(Hehcobaeter 癌易感性IL一1B基因变异检测芯片，通过基因检测芯片一次性地 同时检测胃癌易感基因lL一1B两个位点--31(C／T)和--511(T／C)的多态性，比 较胃癌患者和正常对照这两个位点突变频率，研究其和胃癌发生率之间相关性。 材料与方法 一、样本来源 60例胃癌患者血样均经胃镜确证为胃癌的病人，其中5例有胃癌家族史，78例正常对照血样来源于体 检健康者。 二、主要仪器和试剂 点样仪Affemetrix GMS--417，dNTP(上海生工公司)，Taq 式高速离心机，上海安亭科学仪器公司；TC一25／HPCR扩增仪；HHSII一2电热恒温水浴锅，上海医疗器 械五厂；DHP030恒温箱，上海实验仪器厂，Ba,O(r)BE2．0生物芯片识读仪，上海百傲科技有限公司。 三、Outdo{r)胃癌易感性几一1B基因变异检测芯片的研制 1．探针设计：根据NCBI查得IL一1B基因序列设计探针。设计原则是突变位点尽量位于探针中间，探 针TM值尽量接近，长度在20个碱基左右。 行点样。点样环境要求室温，相对湿度为40％--50％。点样完毕后芯片在75％的相对湿度、40℃、过夜放 置，以利于探针的水化固定。 四、芯片杂交和检测 ●跏 第一届上海生物芯片与消化道肿瘤研究论坛 确定扩增情况理想的引物。 2．5N，M92+ nMn， 个循环，最后72C5mm末次延伸。实验系统采用了UNG酶防污染系统，同时设立阳性对照和阴性对照。 放人冰盒，--20℃放置。 3．芯片杂交和显色： 离心管加入200p1杂交缓冲液和已变性的PCR扩增产物，用枪头吹打均匀，滴加于芯片杂交区域，迅速放人 静置5mm后吸除洗液一；重复此洗涤过程一次。 4．检测 吸去显色液，用双蒸水冲洗杂交区域终止显色反应，放人杂交炉烘干。将芯片反应面朝下扣在galO基 因芯片识读仪的片槽上，按照仪器使用说明进行检测。 五、测序验证 随机抽取20例病人血样染色体DNA的PCR扩增产物进行测序验证，测得基因序列和基因芯片检测 结果进行比较。 结果 的杂合子；样本三显示IL一1B一31(T／c)，IL一1B--31(C／T)，为发生突变的纯合子。 二、138例样本IL—lB基因多态性结果 PO．05)。 l册倒样本几一1B基因多态性结果 第一届上海生物芯片与j自化道肿瘤研究论坛 三、测序结果 测序结果和芯片结果符合率达100％。 讨论 能够增加IL一1p的合成，从而使Hp感染患者胃癌发生的危险性增高。 transition)、一31(T—c 启动区域位点+3954，一511(C—T bletandem (23．o％v12．5％)；单纯H 癌风险显著增高(ORl7．1，95％CI 癌高发区，1I，一B多态性的影响相对小些。