西农萨能羊脂蛋白脂酶基因重组腺病毒干扰载体构建.pdf

320蟋》2011年学术年会 T020058 西农萨能羊脂蛋白脂酶基因重组腺病毒干扰载体的构建 胡仕良 罗 军 王慧朱江江李君 (西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100) 引言／目的 脂蛋白脂酶(LPL)是实质细胞合成和分泌的一种酰基甘油水解酶，主要生理功能是将TG分解为 脂肪酸和单酸甘油酯。研究表明，羊奶中的LPL能通过脂解作用释放游离短、中链脂肪酸。而羊奶中短、 中链脂肪酸含量与羊奶膻味的产生又密切相关。目前山羊LPL基因功能的研究很少，本研究将设计LPL 基因的小干扰RNA，构建LPL基因重组腺病毒干扰载体，为在山羊乳腺上皮细胞中进行LPL基因的功能 研究奠定基础。 材料与方法 InstituteforBiomedical 参考GenBank收录的西农萨能羊脂蛋白脂酶基因序列，利用Whitehead I和Xho Loop区、终止序列和酶切位点(BamH 化TOPl0感受态细胞，提取质粒，ScaI酶切鉴定并送公司测序。 结果 I酶切电泳检测，结果显示，在4．5kb处有明显条带，且 对pENTR—CMV-GFP—U6．shRNA质粒进行Sca I酶切，电泳检测显示四条带， 测序结果正确，证明入门载体构建成功。提取pAd／PL—DEST重组质粒经Sca 且位置与预期一致，证明成功获得鼋组腺病毒干扰载体。经PacI线性化的重组腺病毒质粒可以直接用于 转染，便于下一步LPL基因功能研究。 讨论 LPL在与人类相关疾病方面的研究比较广泛，但与脂肪酸代谢进而与LIJ羊奶膻味形成机制方面的研究较 少，因此本研究中选择构建LPL基因的重组腺病毒干扰载体，其在原代细胞中可以高效表达针对目标基 中含有的ccdB的负筛选基因、氨苄青霉素抗性基因及氯霉素抗性基因，能极大地提高重组腺病毒质粒 的筛选效率，保证了试验的顺利进行。本研究成功构建了西农萨能羊LPL基凶的重组腺病毒干扰载体， 为迸一步研究LPL基因的功能奠定了基础。 参考文献(略)