山羊精子介导基因转移(SMGT)机理的研究.pdf

·扬州· 第十六次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 ·185· 山羊精子介导基因转移(SMGT)机理研究 赵永聚，赵中权，王炜，王剑，王岭斌，于明举。李尧锋 (西南大学动物科技学院，重庆400716) 引育 精子介导转基因方法(sperm-mediatedgenetransfer，SMGT)是生产转基因动物的有效途径，具有简便、高效特 点，但机制至今不明确，成了限制此方法发展运用的瓶颈和世界性难题，也造成SMGT存在着极大的随机性和不确 定性。DNA的内化转运受到精子质膜分子的严格调控，仅有少量结合DNA能被内化转运到精子细胞核，极大的降 低了精子介导基因转移效率。我们前期研究发现精子供体对精子载体法制备转基因动物有显著影响，并发现不同 品种的山羊精子结合内化外源DNA能力存在显著差异。本研究从精子内化外源DNA能力存在品种差异人手。以 因的遗传多样性，并与精子内化外源DNA能力进行相关性分析，探索产生品种差异的分子机制，为高内化转运能 力精子供体的筛选以及人工干预提高外源DNA的内化转运提供理论依据和实践指导，最终为建立简单、稳定、高 效的精子介导转基因方法学奠定基础。 材料方法 hircus)为研究对象，参考GenBank发表的绵羊(Ovis 以山羊(Capra 它动物的CWmRNA序列，通过RT-PCR方法克隆了山羊CW基因，并对其核苷酸序列、氨基酸序列和蛋白质 高级结构进行了分析，检测CD4基因在山羊不同组织中表达水平，流式细胞技术分析了CD4蛋白在精子膜上的定 位、分布。共保温的转染方式比较研究7个品种60只山羊个体的精子对外源DNA的内化转运能力；通过PCR- 力相关分析。制作山羊、大鼠和小鼠皋丸及附睾石蜡切片，SABC免疫组化法检测山羊、大鼠和小鼠生精过程中 CD4蛋白的表达，原位杂交检测CD4mRNA的表达。 结果 本研究首次克隆了山羊C洲基因，cDNA序列为1 全部结合在精子顶体后区及尾部的质膜上，与精子结合外源DNA位置一致。建立了山羊精子介导转染外源DNA PCR-SSCP结果表明 方法和检测体系，不同品种山羊内化外源DNA的能力不同。147个样本cD4基因外显子6 在编码区700 bp处存在G／A突变，引起了234位氨基酸发生G／R突变。在两种基因型个体中．BB型公羊的精子 内化外源DNA能力显著高于从型公羊的精子，B型等位基因可能与精子内化外源DNA效率成正相关。CD4蛋 白在山羊、大鼠和小鼠睾丸、附睾和成熟精子都存在表达。CD4mRNA在山羊、大鼠和小鼠睾丸和附睾存在表达。 成熟山羊精子不表达C阴nLP．NA。 讨论与结论 山羊的精子结合外源DNA的能力表现出品种间差异，进一步分析结合率和内化率之间的差异，可将山羊分为 3种类型：①结合率和内化率都较高；②结合率高而内化率低；③结合率和内化率都较低．筛选出极端个体。首次研 究了山羊CD4基因多态性与精子内化转运外源DNA能力的相关性，揭示外显子6SNP位点可能是影响精子内化 外源DNA能力的因素之一，其B型等位基因可能是精子内化外源DNA能力的分子标记之一。 关t词：SMGT；山羊；精子介导 (XDJK2010C092)资助。