乙酰乳酸合酶活性的简易测定方法建立.pdfVIP

第 18卷第 2期 江 西 农 业 大 学 学 报 V0l+18， 1996年 6月 ActaAgrictthttraeUniversltatisJiangxiensis June，1996 乙酰乳酸合酶活性的简易测定方法建立 。 堕坚竖 兰皇壁 汤日圣 李永丰 梅传生 瞿其楷。 刘宁政 (1江苏省农科院遗传生理所 ，南京 210014}2江苏省农科院现代化所 ，南京 210014D3昆山市农业局 215300I4江宁县农业局 211100) 摘 要 乙酰乳酸舍群 (EC4，I，3，18)(简称ALS)是磺酰碌类等新壅除草剂 的靶标。该酶催化 2个丙 酮酸(或 1十丙酮酸与 1个 Ⅱ-丁酮酸)形成乙酰乳酸(或 乙酰羟丁酸)．利用间接 比色法测定该酶 活性 ，即将产物乙酰乳酸脱羧形成 3一羟基丁酮 ，再与肌酸及甲蓁酚形成粉红色复合物 ，该复合物 在 530衄 处有最大吸收 。本文对影响测定该酶活性 的各种日素作 了比较 ，认为提取藏中省去甘 油 ，提取藏及反应液中省去FAD，提高反应液中丙酮酸钠浓度至 100mmol／L，降低星色剂浓度至 0．083 (体积分数)肌酸 ／O．83 (质量分数)甲萘酚能提高该测定方法的准确性 与灵敏度 ，降低 成本 ，由此建立了适用于测定罔草等杂草ALS活性的技术。 关键词；乙酰乳酸台酶活性I测定方法 绿黄隆I罔草 中围分类号 ：旦 03 cf 、 。 l 乙酰乳酸合酶 (Acetolactatesynthase，EC4，1，3，18，简称 ALS)又称乙酰羟酸合酶，是 合成支链氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的第 1十酶。它催化 2十丙酮酸形成乙酰乳 酸和CO。或催化丙酮酸与a一丁酮酸形成乙酰羟丁酸和CO 1【]。近年来发现该酶是磺酰脲类 等新型除草荆的作用位点啪，所 以受到较大的重视，该酶活性已被 用作鉴定杂草抗性的一十 生化指标。巳建立的测定 ALS活性的方法 中所需试剂昂贵，如 FAD(黄素腺嘌呤二核苷 酸)、SephadexG-25等0]，国内一般实验室不易购买。目前国内尚未见报道这种酶的测定方 法．为此，我们在利用现有方法测定麦田杂草ALS活性初步获得成功的基础上Ⅲ，辕为系统 地探索了测定 ALS括性的各种必需条件 ，建立了适用于杂草ALS活性测定的简易方法。 1 材料与方法 1．1 供试材料 罔草幼穗的詹伤组织。诱导培养基与继代培养基均为MS+2，4-D2mg／L+KT0．5+ 1996-03-03收藕 ·214 · 江 西 农 业 大 学 学 报 18卷 质量浓度为 3 Sucrose，pH5．8，用质量分数为 0．6 琼脂粉固化 ，暗下 28℃培养，培养周期 40d． 1．2 ALS活性测定 1．2．1 基本原理 通过间接法测定 ALS活性 。即将产物乙酰乳酸通过脱羧反应转变成3一 羟基丁酮 (acetoin)，再与肌酸 (creatine)及 甲萘酚 (naphtho1)形成复合物 ，这种粉红色复合物 可以在分光光度计 530m 处左右测得最大吸收。 草 瞽 岫 ∽ ㈨ ¨ 1．2．2 ALS提取 往 3～5g愈伤组织(按 1g：1mL比例)加入提取介质 (i00reotol／L)磷 酸 钾 缓 ．冲 液，内含 1mmol／L丙酮酸钠 ，0．5mmol／LTPP，1mmol／LDTT，5mmo|／L MgC12，pH7．5)匀浆，匀浆液于 25000r／mira离心 20min，倾出上清液即为粗酶液 ，置 4℃ 保存待用。以上操作均在 4℃下进行。 1．2．3 ALS活性测定 0．5mL反应介质(50mmol／L磷 酸 钾 缓 冲 液，内含 1mmol／L MgC1z，200mmol／L丙酮酸钠，1mmol／LTPP，pH7．0)，